[發明專利]一種耐有機溶劑的產葡萄糖苷酶地衣芽胞桿菌及其應用

有效

• 申請號: 201110343655.5
• 申請日: 2011-11-03
• 公開（公告）號: CN102433270A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 陳堅;周蘭蘭;李江華;堵國成;劉龍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/26;C12P19/14;C12P19/60;C12R1/10
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種產葡萄糖苷酶的芽胞桿菌及其應用，尤其是一種耐有機試劑的產葡萄糖苷酶地衣芽胞桿菌及其應用。

背景技術

α-轉移葡萄糖苷酶(α-transglucosidase)又稱α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)，它可以從低聚糖類底物的非還原性末端切開α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖或將游離出的葡萄糖殘基以α-1，6糖苷鍵轉移到另一個糖類底物上，從而得到非發酵性的低聚異麥芽糖(以下簡稱IMO，主要包括異麥芽糖，潘糖，異麥芽三糖等)糖脂或糖肽等。在微生物中，細菌、酵母、霉菌等某些菌株能分泌僅.葡萄糖苷酶。已報道的能產此酶的菌種有曲霉，其中以黑曲霉產酶量較高，以及乳酸菌，包括干酪乳桿菌、雙歧桿菌等。在動物腸道中也有a.葡萄糖苷酶的分泌，用來幫助消化吸收麥芽糖和麥芽低聚糖，如王志江，魏紅福在蜜蜂的腹部組織中分離純化到α-葡萄糖苷酶。關于嗜熱微生物的耐高溫α-葡萄糖苷酶基因也已有專利和文獻報道。

糖基化合物又稱糖苷類化合物或配糖體，在生物，醫藥，食品等領域均有著廣泛的利用價值。在合成糖苷化合物方面，糖苷酶較糖基轉移酶來源廣泛，比較穩定，能接受不同結構的底物，可直接以非保護或非活化的糖作為糖基供體，因此，廣泛用于酶促糖苷化反應合成各類糖基化合物。目前國內外糖基化合物的研究熱點主要是黃酮衍生物的合成，但是由于大多數黃酮苷元及其黃酮苷類在水相中溶解度低，限制了其制劑的開發。已報道的黃酮類化合物的糖苷化反應主要是采用植物細胞、微生物和游離酶的生物轉化。植物細胞中含多種酶系，因此以植物細胞進行生物轉化的糖基化位置較多，糖基化產物也相對復雜；且底物在植物細胞懸浮液中溶解度會更低，影響產率。以微生物細胞進行的生物轉化由于底物溶解度等問題通常產率也較低。比較多的報道是關于國外采用基因工程技術改造生成糖基轉移酶用于黃酮類物質的糖基化作用，但是這種方法無法改善底物溶解度低的問題，故產率依然很低。非水相反應可解決酶催化反應時底物溶解度低的問題。

傳統的酶催化反應主要在水中進行，但隨著對酶的深入研究，發現酶反應在非水相介質中具有許多水相不具備的優勢，如增加非極性底物的溶解性，通過控制反應平衡移動的方向極大地提高產率等。近年來，有關在有機介質中的酶催化反應研究是酶工程中一個活躍的領域，耐有機溶劑葡萄糖苷酶的應用前景更為廣闊。目前國內外關于耐有機溶劑產糖苷酶菌株的報道比較少，還未見有關于地衣芽胞桿菌產耐有機溶劑糖苷酶的報道，且此菌株糖基化槲皮素生成槲皮苷的產量較高，優勢較為明顯。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種耐有機溶劑的產葡萄糖苷酶地衣芽胞桿菌(Bacillus?licheniformis)BBE11-1，可應用于食品工業、藥物合成、飼料加工。

所述地衣芽胞桿菌(Bacillus?licheniformis)BBE11-1于2011年9月18藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2011319。

所述地衣芽胞桿菌初始發酵用培養基組成如下：可溶性淀粉5g/L，蛋白胨25g/L，酵母粉3g/L磷酸氫二鉀3g/L，磷酸二氫鉀1g/L，pH自然。

所述地衣芽胞桿菌的最佳產酶培養基為：蔗糖7.5g/L，胰蛋白胨25g/L，酵母粉4.0g/L，FeSO₄·7H₂O?0.250g/L。

本發明提供的菌株，具有在耐二甲基甲酰胺特性并且葡萄糖苷酶活性較高，為國內首例有關α-葡萄糖苷酶的地衣芽胞桿菌菌株；采用本發明所篩選的菌株對槲皮素進行糖基化反應，經分析后可以產生至少一種糖基衍生物；采用本發明篩選的菌株發酵12小時的葡萄糖氧化酶活最高達到227.8U?L^-1，轉化率達到14.81％，槲皮素產量達到0.148g?L^-1，轉化率遠遠高于國內有關槲皮素糖基化的報道。

具體實施方式

實施例1產葡萄糖苷酶菌株的初篩篩選方法

1.樣品來源為無錫當地化工廠附近的土壤，取適量土樣放入含無菌水和玻璃珠的三角瓶中，置37℃搖床混勻、打碎做成菌懸液；

2.將菌懸液加入到初篩培養基中，37℃200rpm，培養24h；

初篩培養基(LB)：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，DMF10％.pH自然；

3.將菌懸液過濾稀釋成10^-4、10^-5、10^-6?3個稀釋度涂布LB平板。涂布后37℃培養24h；