[發明專利]產酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法

有效

• 申請號: 201110343097.2
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102507934A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 林鵬;馮建軍;王藝磊;郭松林
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/531;G01N21/64
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.產酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于所述產酸克雷伯氏菌Klebsiella?oxytoca已于2011年07月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCC?No.5060；

所述檢測法包括以下步驟：

1)產酸克雷伯氏菌菌株的微生物學鑒定；

2)制備免抗產酸克雷伯氏菌抗體；

3)IgG的Eu³⁺標記及純化；

4)建立產酸克雷伯氏菌TRFIA檢測方法

將產酸克雷伯氏菌菌株首先用無菌生理鹽水洗滌，4500r/min，離心5min，棄上清；Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖溶液稀釋，取100μL加入到96孔微孔板中包被，用洗滌液沖洗，每孔加入200μL?1％的BSA，37℃封閉2h，洗滌，加入1∶320稀釋的Eu³⁺-IgG溶液100μL，37℃振動孵育1h，用洗滌液沖洗，每孔加入200μL增強液，振蕩，多標記分析儀上測量熒光讀數CPS；設碳酸鹽包被液作陰性對照，以樣品孔的CPS值與對照孔的CPS值之比大于2時判斷為陽性。

2.如權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于在步驟1)中，所述產酸克雷伯氏菌菌株的微生物學鑒定的具體方法是：采用Biolog自動生化鑒定系統進行鑒定。

3.如權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于在步驟2)中，所述制備免抗產酸克雷伯氏菌抗體的具體方法包括以下步驟：

(1)將產酸克雷伯氏菌菌株接種于0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培養液中，27℃培養24h，用甲醛及加熱兩種方法滅活，離心，再加入無菌生理鹽水洗滌，調整細菌濃度至6×10⁸cfu/mL備用；

(2)選擇2只健康的2～3kg的新西蘭大白兔，背部兩側皮下多點注射免疫，分4次免疫，免疫間隔期為2周，第1次免疫時與弗氏完全佐劑1∶1混合、乳化，第2次免疫時與弗氏不完全佐劑1∶1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射劑量為1mL；

(3)最后一次免疫10天后，耳靜脈采血，分離血清，用試管凝集法測定抗血清效價，效價達到1∶1280以上方可使用；

(4)采用SPA親和層析法從從血清中純化抗體，然后脫鹽和冷凍干燥。

4.如權利要求3所述的產酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于在步驟(1)中，所述離心的條件采用4500r/min，5min。

5.如權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于在步驟3)中，所述IgG的Eu³⁺標記及純化的具體方法包括以下步驟：

1mg的IgG抗體溶于250μL?Na₂CO₃-NaHCO₃緩沖溶液中，與0.2mg的Eu³⁺標記試劑充分混勻，4℃磁力攪拌12h，在pH?7.8的Tris-HCl緩沖液4℃透析24h，其間換透析液兩次。通過蛋白純化系統用Sephadex?G-50柱層析，洗脫液仍為Tris-HCl緩沖液，監測280nm處吸光度并合并收集蛋白峰，計算合并液中Eu³⁺和IgG的濃度，得到純化的IgG標記復合物Eu³⁺-IgG，復合物溶液中Eu³⁺和IgG濃度分別為4.5×10^-6mol/L和1.5×10^-6mol/L，標記比為3。

6.如權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于在步驟4)中，所述Eu³⁺-IgG溶液的工作濃度分別采用1∶80、1∶320、1∶1280、1∶5120、1∶20480和1∶81920稀釋，選擇熒光讀數CPS接近10⁶且P/N值最大的稀釋度為最佳稀釋度。

7.如權利要求1所述的產酸克雷伯氏菌的時間分辨熒光免疫檢測法，其特征在于所述包被的條件分別采用4℃、37℃和60℃的包被溫度，12h、18h和24h的包被時間，固定Eu³⁺-IgG及菌株濃度，觀察P/N值，選擇最高P/N所對應的包被溫度和包被時間。