[發明專利]一種敲除牛MSTN基因的打靶載體及其應用

有效

• 申請號: 201110342216.2
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN103088044A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 李榮鳳;趙麗華;李雪玲;梁浩;云亭
• 申請（專利權）人: 內蒙古大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/11;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/09;A01K67/027
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

1.一種敲除牛肌肉生長抑制素MSTN基因的啟動子捕獲型打靶載體。

2.如權利要求1所述的打靶載體，其包含MSTN基因上下游同源臂3’同源臂和5’同源臂，所述5’同源臂的最后一個堿基為MSTN第一外顯子起始密碼子上游最后一個堿基，在同源臂之間還具有標記基因。

3.如權利要求2所述的打靶載體，其特征在于，所述5’同源臂核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1的8834～10133；3’同源臂核苷酸序列如SEQID?NO：1的15091～21957。

4.如權利要求2所述的打靶載體，其特征在于，所述標記基因包括報告基因EGFP和帶有啟動子PGK的新霉素抗性選擇基因Neo^r。

5.如權利要求1～4之一所述的打靶載體，其為PIII-MSTN，質粒圖譜如圖1所示，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3。

6.一種擴增權利要求1～5之一所述的打靶載體中MSTN基因同源臂的引物，其分別包括5’同源臂和3’同源臂的上游序列和下游序列的兩組PCR引物對。

7.如權利要求6所述的引物，其特征在于，所述引物為：

5’同源臂上游引物：TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC，

5’同源臂下游引物：TTTAAGCTTGGTTTTAAAA?TCAATACAATCTTTT；

3’同源臂上游引物：GATCCGCGGCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGT，

3’同源臂下游引物：AATCCGCGGAGTAGAATGGTCTTGAATGGTTAGGA。

8.一種構建權利要求1～5之一所述打靶載體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)提取牛組織基因組DNA；

2)以權利要求6或7所述的引物用PCR方法從步驟1)的基因組DNA中克隆MSTN基因的長短同源臂，分別為3’同源臂和5’同源臂；

3)將同源臂克隆到表達載體經限制性內切酶和測序分析進行鑒定；

4)將鑒定正確的同源臂連接到基礎載體PIII中，該基礎載體核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，構建得到敲除牛MSTN基因的打靶載體。

9.如權利要求8所述的方法，其中步驟2)所述的PCR方法擴增5’同源臂，其反應條件為：95℃變性50s，60℃復性50s，72℃延伸2min，共35個循環；所述的PCR方法擴增3’同源臂，其反應條件為：95℃變性50s，59℃復性50s，72℃延伸7min，共35個循環。

10.一種敲除牛MSTN基因的方法，其特征在于，利用電轉染的方法將權利要求1～5之一所述的打靶載體導入胎兒成纖維細胞中，通過同源臂的置換，達到敲除MSTN基因的目的。

11.如權利要求1～5之一所述的打靶載體在培育肉用牛品種中的應用。