[發明專利]一種同步檢測豬圓環病毒2型、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法

無效

• 申請號: 201110341387.3
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102382905A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 邊傳周;鄭鳴;王永芬;王老七
• 申請（專利權）人: 鄭州牧業工程高等專科學校
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 陳浩;牛愛周

技術領域

本發明涉及一種環介導間接PCR檢測豬圓環病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的方法，屬于生物醫藥體外分子診斷技術。

技術背景

我國是養豬大國，養殖規模化、集約化程度不斷提高，以病毒性傳染病為首的豬病是目前影響養豬效益的主要因素之一，給養豬業造成了極大危害，尤以高致病性PRRSV引起的豬高熱病為主。在引起豬高熱癥狀的眾多病毒因子中PRRSV扮演重要角色，是主要病原，其次為PCV2，再次為CSFV等。近年來，PRRSV在我國豬群中感染已極為普遍，并常因感染豬的免疫抑制，導致其它病原體的混合感染；PCV2感染無明顯的臨床癥狀，但可破壞免疫系統，造成免疫抑制，易繼發并發其它病原體感染，尤其是和PRRSV的混合感染，使患病豬的致死率顯著上升；由于PRRSV或PCV2感染豬的免疫抑制，促使了豬瘟的進一步流行，豬瘟的發病率和死亡率都有所回升。隨著PRRSV、PCV2和CSFV等病毒因子在大范圍內長期流行，病毒變異，毒力增強，一種和兩種以上病原的混合感染，導致豬高熱疾病仍將呈高發態勢，如何防控仍將是未來很長時間內我國養豬業必須面臨的實際問題。這3種病毒是引起豬“高熱病”的主要病原，目前針對這3種病毒的實驗室檢測多采用剖檢觀察病理組織變化，再綜合臨床癥狀進行初步判斷，對于多病毒混合感染的豬“高熱病”，則很難通過剖檢鑒別不同病原，而血清學檢測如中和試驗、ELISA和膠體金試紙等檢測技術，普遍存在靈敏度和特異性低，不利于流行病監測和疾病管理。PCR技術是一種高度特異性和敏感性的分子診斷技術，廣泛應用于上述3種病原的檢測。常規PCR是利用1對特異性引物檢測1種病原，對于多病原的混合感染需要多次PCR檢測，檢測時間長、成本高；在常規PCR基礎上發展起來的多重PCR是在1支PCR管中利用多對特異性引物進行PCR擴增，可同時檢測多種病原感染，在臨床上對混合感染的鑒別診斷具有獨特的應用價值。然而，多重PCR除具有易污染，假陽性和假陰性較高等常規PCR的缺點外，由于多重PCR擴增一般涉及2對或2對以上的引物，引物之間的交叉反應常常導致多重PCR檢測靈敏度和特異性出現不同程度的下降，限制了多重PCR的應用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種同步檢測豬圓環病毒2型、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，以實現對3種病毒的環介導間接PCR檢測。

為了實現上述目的，本發明的技術方案采用了一種同步檢測豬圓環病毒2型、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的方法，利用PRRSV、PCV2和CSFV3種病毒核酸設計3對特異性探針，利用PCR制備探針標記的報告基因，然后再通過報告基因的環化和反向PCR擴增，實現對3種病毒的環介導間接PCR檢測。

具體包括以下步驟：

(1)探針和引物的設計

根據GenBank數據庫中豬圓環病毒2型(PCV2)、豬瘟病毒(CSFV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的高度保守性核苷酸序列設計3對特異性探針；選擇大豆Lectin基因作為報告基因，并以此基因片段的核苷酸序列為模板設計1對正向PCR擴增引物和1對反向PCR擴增引物；將3對特異性探針分別置于正向PCR擴增引物的上下游引物的末端，即構成3對針對不同病毒的標記用引物，將標記用引物和反向PCR擴增引物進行合成，用于環介導間接PCR擴增；

(2)病毒核酸的制備；

(3)報告基因的制備；

用3對標記用引物分別擴增大豆Lectin基因，經PCR產物回收后獲得3種標記的報告基因，每條報告基因兩端帶有2條探針，此3種報告基因分別針對不同病毒；

(4)單病毒環介導間接PCR檢測；

將不同的報告基因與待檢核酸混合，報告基因攜帶的探針與目的基因進行雜交，形成雜合分子，之后在嗜熱DNA聚合酶和嗜熱DNA連接酶作用下，經缺口補平及連接，實現報告基因的環化，再采用反向PCR擴增報告基因，間接檢測3種病毒；

(5)多病毒環介導間接PCR檢測；

將3種報告基因與待檢核酸混合，經探針雜交、缺口補平及連接，實現報告基因的環化，再采用反向PCR擴增報告基因，間接檢測3種病毒。

所述步驟(1)中用于檢測PCV病毒的標記引物序列為：

上游引物P1TCAAGAAGCCTCATCAC

下游引物P2CTGTCATTTCACCAGGGTTTAGTT

其中斜體部分為探針序列；

所述步驟(1)用于檢測PRRSV病毒的標記引物序列為：