[發明專利]一種縮短DNA模板的DNA測序方法及其應用

有效

• 申請號: 201110341269.2
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102344967A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 肖鵬峰;浦丹;謝宏梅;王文捷;陸祖宏
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

1.一種縮短DNA模板的DNA測序方法，其特征在于（1）引入一段包含IIS限制性內切酶識別位點的目標寡核苷酸序列作為序列測定的起點，采用合成或者連接測序方法將固定DNA模板中的一小段序列測定；（2）停止該測序引物的測序，并加入四種dNTPs單體延伸測序引物鏈，使DNA模板成為雙鏈；（3）縮短DNA模板：用限制性內切酶處理預先設定包含酶識別序列的連接子，將已經測定的DNA模板中的一小段序列斷裂；（4）將測序引物、且包含酶識別序列的雙鏈寡核苷酸片段，連接到上述切割后的縮短DNA模板上；（5）變性，除去未固定的DNA鏈，重新獲得DNA模板；（6）雜交測序引物，繼續對固定DNA模板中的一小段序列進行測定；（7）重復步驟（2）到（6），直到未測定DNA模板序列測定完成；所述DNA模板中的一小段序列測定是根據酶切位點距離酶識別位點的核苷酸個數確定的，已經被測序的序列片段是酶識別位點切割DNA模板的位置；DNA模板的每次制備過程中均需引入酶識別位點，酶切位點距離酶識別位點的核苷酸個數是確定的。

2.根據權利要求1所述的縮短DNA模板的DNA測序方法，其特征在于酶識別序列是指限制性內切酶識別位點，其斷裂位點為距離識別位點的2-30個堿基。

3.根據權利要求1所述的縮短DNA模板的DNA測序方法，其特征在于酶識別序列是指限制性內切酶識別位點，，最佳斷裂位點為距離識別位點8-25個堿基。

4.縮短DNA模板的DNA測序方法在測定人基因組中的應用，其特征在于步驟為：

（1）將人基因組用Fok?I酶在37℃處理2小時后，超聲破碎成大小為50-1000堿基的片段，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進行連接，其中的一個通用連接子的寡核酸序列與擴增引物的序列完全互補，而另一個連接子的寡核酸序列包含了Mly?I酶能識別序列，且該特定區域位于模板測序最開始位置；

（2）將這些連接臂連接的片段化核酸序列與固定連接子互補序列到微珠進行乳液并行PCR反應，擴增片段化的人全基因組，并將這些微珠固定到平板基片上，并通過變性得到人全基因組單鏈DNA測序模板；

（3）將3’末端含有Mly?I酶能識別序列的測序引物與固定的DNA模板雜交；

（4）在DNA模板指導下，采用商業化的SOLiD連接測序試劑及其測序方法，測定所有DNA模板的前9個堿基；

（5）當第9個堿基測定完成后，清洗反應池，加入四種dNTPs單體，在DNA聚合酶的作用下，37℃反應0.5小時，延伸測序引物鏈，并與DNA模板成為雙鏈，并清洗反應池；

（6）將Mly?I酶及其緩沖液加于上述反應池中，在37℃反應2小時，切割雙鏈DNA其斷裂位點為識別序列3′末端下游9或者5′末端下游11個堿基處，并用T4激酶將5末端磷酸化；

（7）將新測序引物片段，且包含下列酶Mly?I識別序列，所述上游引物應補齊2堿基缺口：?

對應測序引物序列：5'...GGCGGA(N)₂；?對應測序引物序列互補序列，p表示磷酸基團：3'?...?CCGCCT'p?；

以雙鏈寡核苷酸片段，與上述切割、縮短的雙鏈DNA模板在T4連接酶作用下反應0.5小時；

（8）用0.1M?NaOH處理上述連接后的雙鏈DNA模板10分鐘，變性獲得新單鏈DNA模板；

（9）重復步驟（4），得到新模板上1-9個堿基的序列信息；

（10）重復步驟（4）到（9），進行循環測序，每重復一次增加9個堿基位置的序列測定長度；

（11）將所有位置上DNA模板的堿基序列片段完成組裝，得到人全基因組DNA序列。

5.縮短DNA模板的DNA測序方法在測定大腸桿菌基因組中的應用，其特征在于步驟為：

（1）將大腸桿菌基因組用Mme?I酶在37℃處理2小時后，超聲破碎成大小為50-1000堿基的片段，并在連接酶的作用下將這些片段化核酸序列用一對通用連接子進行連接，其中的一個通用連接子的寡核酸序列與擴增引物的序列完全互補，而另一個連接子的寡核酸序列包含了Mme?I酶能識別序列，且該特定區域位于模板測序最開始位置；

（2）將這些連接臂連接的片段化核酸序列與固定連接子互補序列到微珠進行乳液并行PCR反應，擴增片段化的大腸桿菌基因組，并將這些微珠固定到平板基片上，并通過變性得到大腸桿菌基因組單鏈DNA測序模板；

（3）將3’末端含有Mme?I酶能識別序列的測序引物與固定的DNA模板雜交；

（4）在DNA模板指導下，采用商業化的Solexa?延伸測序試劑及其測序方法，測定所有DNA模板的前18個堿基；

（5）當第18個堿基測定完成后，清洗反應池，加入四種dNTPs單體，在DNA聚合酶的作用下，37℃反應0.5小時，延伸測序引物鏈，并與DNA模板成為雙鏈，并清洗反應池；

（6）將Mme?I酶及其緩沖液加于上述反應池中，在37℃反應2小時，切割雙鏈DNA其斷裂位點為識別序列3′末端下游18或者5′末端下游20個堿基處，并用T4激酶將5末端磷酸化；

（7）將新測序引物片段，且包含下列酶Mly?I識別序列，上游引物需要補齊2堿基缺口：?

對應測序引物序列：5'?...?TCCRAC?(N)₂?；

對應測序引物序列互補序列，p表示磷酸基團：3'?...?AGGYTGp；

以雙鏈寡核苷酸片段，與上述切割、縮短的雙鏈DNA模板在T4連接酶作用下反應0.5小時；

（8）用0.1M?NaOH處理上述連接后的雙鏈DNA模板10分鐘，變性獲得新單鏈DNA模板；

（9）重復步驟（4），得到新模板上1-18個堿基的序列信息；

（10）將所有位置上DNA模板的36個堿基序列片段完成組裝，得到大腸桿菌基因組全基因組DNA序列。