[發明專利]人卵巢癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法

有效

• 申請號: 201110340841.3
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102586414A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 傅松濱;于旸;朱靜;孟祥寧;孫文靖;張春玉
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種人卵巢癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，屬于雙微體序列測定技術領域。

背景技術

雙微體(double?minute?chromosomes，DMs)是腫瘤細胞內成對存在、不含著絲粒、可自主復制的環狀染色小體，是腫瘤細胞基因擴增的主要表現形式之一。雙微體存在于腫瘤細胞和某些經過化療藥物作用的細胞，在正常細胞中未見雙微體檢出。雙微體自1962年首次在人結腸癌細胞中發現以來，在絕大多數實體瘤和血液系統腫瘤中皆檢測到雙微體的存在。臨床標本檢測結果顯示，18％的乳腺癌、29％的卵巢癌、44％的結腸癌、20％-30％的小細胞肺癌和12.5％的血液系統腫瘤中存在著雙微體。同時，雙微體的存在與腫瘤的惡性程度的增高和腫瘤耐藥性的產生密切相關。研究顯示，通過雙微體擴增的基因主要包括為細胞提供生存優勢的癌基因和耐藥表型的耐藥基因。這些基因有的是一個完整的基因，而另外一些則是由兩個不同基因形成的融合基因。這些基因在腫瘤演進和耐藥性形成過程中發揮重要作用，因此對雙微體上這些基因的確認也就顯的格外重要。

現有研究雙微體的結構主要采用細胞遺傳學手段，應用光學顯微鏡、電子顯微鏡、原子力顯微鏡和熒光原位雜交(FISH)等對雙微體結構進行檢測。這些方法都是從宏觀上也就是染色體水平對雙微體進行描述，不能提供雙微體的微觀信息(即DNA的序列特點)。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有研究雙微體的結構主要采用細胞遺傳學手段，應用光學顯微鏡、電子顯微鏡、原子力顯微鏡和熒光原位雜交等對雙微體結構進行檢測。這些方法都是從宏觀上也就是染色體水平對雙微體進行描述，不能提供雙微體的微觀信息的問題，進而提供一種人卵巢癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法。

本發明一種人卵巢癌細胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法步驟如下：

一、人卵巢癌細胞UACC-1598的培養及細胞完整雙微體的脈沖場凝膠電泳分離；

1、樣品制備

人卵巢癌細胞UACC-1598在含10％FBS的RPMI-1640培養基中，于5％CO₂、37℃條件下進行培養；收集對數生長期、匯合率為70％～80％的人卵巢癌細胞UACC-1598，計數后重懸于PBS，使細胞密度為1～2×10⁸細胞/mL，并在37℃水浴中孵育；加入等體積37℃的1.4％低熔點瓊脂糖，迅速混勻后倒入潔凈模具中，4℃放置10～15min使其凝固；將膠塊從模具中取出后置于3～5倍體積的細胞裂解液中于37℃水浴中震蕩孵育約90min至膠塊透明；棄細胞裂解液并用洗液(Washing?buffer)反復洗膠塊3次后置于3～5倍體積的蛋白酶K溶液，37℃水浴中震蕩孵育6～12小時；Washing?buffer洗滌三次后，置于貯存液中4℃保存；

2、脈沖場凝膠電泳