[發明專利]用于檢測小鼠仙臺病毒的引物、探針及其方法

有效

• 申請號: 201110340728.5
• 申請日: 2011-11-02
• 公開（公告）號: CN102337358A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 譚淑萍;李萃;王剛;蔣立新;周志文
• 申請（專利權）人: 舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
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技術領域

本發明涉及生物檢測領域，特別是涉及一種用于檢測小鼠仙臺病毒的引物、探針及其方法。

背景技術

自然感染實驗動物的病毒很多，根據對人類的危害性，可將其分為三類；一類為人獸共患病病毒，能夠感染人與靈長類動物；二類目前尚無跡象表明感染人，但能在體外培養的人、猿和猴源性細胞中進行復制，對人類有潛在危險性；三類病毒在自然條件下僅感染動物本身，目前尚無跡象表明能夠感染人，因此對人類威脅不大。

現今，小鼠作為單克隆抗體、蛋白類藥物等生物制品的一個主要來源，具有潛在的病毒污染。在《中華人民共和國藥典(2010年版)》三部中，規定了鼠源性生物制品需質檢的8種鼠源病毒，其中小鼠仙臺病毒屬于一類，人獸共患病病毒，能夠感染人與靈長類動物，對人體來說有很大的危險性。

仙臺病毒(Sendai?virus，SEV)屬于副粘病毒科，副粘病毒屬。1953年首次于日本仙臺發現，并分離出了第一株病毒Fushimi株，之后人們對仙臺病毒進行了廣泛的研究和報道。

仙臺病毒為單股負鏈RNA病毒，病毒粒子多是呈圓形，直徑130～250nm。病毒內部由直徑約18nm的螺旋狀對稱結構的核蛋白組成，外包有脂蛋白囊膜，其上有放射狀排列的纖突，纖突長8～15nm，寬2～4nm。

小鼠仙臺病毒的自然宿主是嚙齒類動物。仙臺病毒可凝聚和溶解多種動物的紅細胞，如小鼠、豚鼠、人、雞、大鼠、綿羊、兔的紅細胞。

小鼠感染本病后可有兩種表現型。慢性型多見于幼鼠至42日齡的小鼠，呈亞臨床感染，病毒在鼠群中長期存在，并呈地方性流行。急性型病鼠常表現臨床癥狀，即被毛粗亂、呼吸困難、消瘦等。孕鼠死胎率提高，新生乳鼠死亡率上升。同時小鼠仙臺病毒也可感染人類，引起呼吸道系統疾病。

為了客觀評價小鼠生物制品的質量，確保人民健康必將起到積極的作用，藥典制定了鼠源病毒檢測的標準。其中規定的鼠源病毒檢測方法有：細胞試驗、動物抗體產生實驗和雞胚感染實驗。這些方法從生物效應角度來檢測鼠源病毒的潛在污染，檢測手段復雜費時，周期長，且對操作的實驗室有一定要求，不宜作為一種常規的指導生產的質控手段。

而目前發展十分成熟的實時熒光定量PCR技術(Real-time?Fluorence?Quantitative?Polymerase?Chain?Reaction簡稱Real?Time?PCR)檢測靈敏度高，簡單方便，且對實驗室要求也很低。Real?Time?PCR于1996年由美國Applied?biosystems公司推出，是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，使每一個循環變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(or?cDNA)的起始濃度進行定量分析的方法。該方法自產生以來，不斷發展完善，特別是隨著Taqman熒光探針的廣泛應用，到目前為止該技術已經非常成熟。Taqman熒光探針的PCR檢測是指進行PCR擴增時，在反應體系中加入一對引物的同時還加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基因和一個淬滅熒光基團。當探針完整時，報告基因所發射的熒光信號被淬滅基因吸收，擴增時隨著Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其5’-3’外切核酸酶活性將探針酶切降解，報告熒光基團與淬滅熒光基團分離，從而熒光檢測系統可以監測到熒光信號，模板每復制一次，就有一個探針被切斷伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是一對一關系，所以信號累積與PCR產物完全同步。整個反應結束后，便可得到一條擴增曲線，由已知濃度標準樣品的擴增曲線可以得到一條標準曲線，根據該標準曲線以及樣品中的擴增曲線可對樣品進行定量分析。

實時熒光定量PCR技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該已被廣泛用于免疫分析、細菌、病毒檢測等多個領域。迄今為止，實時熒光定量PCR技術檢測小鼠仙臺病毒方面還未見有報道，無疑有著很廣闊的發展空間。

發明內容

為了解決現有小鼠仙臺病毒檢測方法的不足，本發明提供了一種實時熒光定量PCR檢測小鼠仙臺病毒的引物、探針及其方法，該方法簡單方便、靈敏度高且檢測時間短。

本發明的一個目的是提供一對用于檢測小鼠仙臺病毒的引物。

本發明提供的引物，是由具有序列表中的SEQ?ID?NO：1的上游引物與具有序列表中的SEQ?ID?NO：2的下游引物組成的一對寡核苷酸。