[發(fā)明專(zhuān)利]用于檢測(cè)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型的引物、探針及其方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110340710.5
• 申請(qǐng)日: 2011-11-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102337357A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚淑萍;李萃;王剛;蔣立新;周志文
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.用于檢測(cè)小鼠呼腸孤病毒III型的引物，其特征在于，所述引物是由具有序列表中的SEQ?ID?NO：1的上游引物與具有序列表中的SEQ?IDNO：2的下游引物組成的一對(duì)寡核苷酸。

2.一種與權(quán)利要求1所述引物配合使用的探針，其特征在于，所述探針具有序列表中的SEQ?ID?NO：3的核苷酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于，所述探針5’端連接有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自FAM、VIC、JOE、HEX中的任意一種，所述熒光淬滅基團(tuán)選自TAMRA或Eclipse。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的探針，其特征在于，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA。

6.一種用于檢測(cè)小鼠呼腸孤病毒III型的方法，其特征在于，所述方法使用權(quán)利要求1中所述的引物及權(quán)利要求2～5任一所述的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系還包括RT-PCR擴(kuò)增試劑、陽(yáng)性RNA標(biāo)準(zhǔn)品、酵母tRNA稀釋液、陰性質(zhì)控品、空白對(duì)照。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的退火溫度為60℃。

9.根據(jù)權(quán)利要求6～8任一所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件為：48℃，15min；95℃，10min；95℃，15sec，60℃，40sec，共40個(gè)循環(huán)。

10.根據(jù)權(quán)利要求6～9任一所述的方法，其特征在于，所述方法還包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，方法為：擴(kuò)增含序列表中SEQ?ID?NO：4所示的堿基同源序列的pMD18-T載體，得到190bp的DNA片段，體外轉(zhuǎn)錄所述DNA片段并純化獲得的RNA作為陽(yáng)性RNA標(biāo)準(zhǔn)品，將其十倍稀釋成不同濃度的陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品，以所述陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，得到檢測(cè)小鼠呼腸孤病毒III型的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

11.一種檢測(cè)小鼠呼腸孤病毒III型的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求1中所述的引物及權(quán)利要求2～5任一所述的探針。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的反應(yīng)體系還包括RT-PCR擴(kuò)增試劑、陽(yáng)性RNA標(biāo)準(zhǔn)品、酵母tRNA稀釋液、陰性質(zhì)控品、空白對(duì)照。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR擴(kuò)增試劑為2×Taqman?PCR?Mix、40×Taqman?RT-Enzyme?MIX。

14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性RNA標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)下述方法獲得：擴(kuò)增含序列表中SEQ?ID?NO：4所示的堿基同源序列的pMD18-T載體，得到190bp的DNA片段，體外轉(zhuǎn)錄所述DNA片段并純化獲得的RNA即標(biāo)準(zhǔn)品。

15.權(quán)利要求1中所述的引物或權(quán)利要求2～5任一所述的探針在檢測(cè)鼠源生物制品中呼腸孤病毒III型殘留時(shí)的應(yīng)用。