[發明專利]采用水培技術快速繁殖轉基因青蒿的方法

有效

• 申請號: 201110340421.5
• 申請日: 2011-11-01
• 公開（公告）號: CN102499037A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 唐克軒;陸續;張凌;吳韶龑;江偉民;張芳源;沈乾
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: A01G31/00
• 分類號: A01G31/00
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理

技術領域

本發明涉及的是一種水培種植技術領域的方法，具體是一種采用水培技術快速繁殖轉基因青蒿的方法。

背景技術

青蒿(Artemisia?annua?L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是從其地上部分分離的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法(ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入，科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的功能。可見青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。

目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，使得這種藥物的大規模商業化生產受到了限制。由于青蒿素結構復雜，人工合成難度大，產量低，成本高，不具有可行性。另外，青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多數研究者在根中沒有檢測到青蒿素。因此利用組織培養及細胞工程生產青蒿素的可行性也不高。

隨著青蒿素生物合成途徑研究的逐漸深入以及植物次生代謝工程的不斷發展，利用轉基因技術提高青蒿中青蒿素的含量是一種頗具前景的方法。2009年，本實驗室Zhang等同學在《Biotechnol.Appl.Biochem.》(《生物技術和應用生物化學》)發表了題為“Development?of?transgenic?Artemisia?annua(Chinese?wormwood)plants?with?an?enhanced?content?of?artemisinin，an?effective?anti-malarial?drug，by?hairpin-RNA?mediated?gene?silencing”(“構建RNAi載體并利用轉基因技術使抗瘧疾藥物青蒿素在轉基因青蒿中的含量得到提高。”)的論文，報道了通過轉基因技術可明顯提高青蒿中有效成分青蒿素含量這一實驗結果。目前，本實驗室已得到多個不同品系且青蒿素含量較高的轉基因青蒿。然而，轉基因青蒿一般為雜合體，不具備遺傳穩定性，后代中基因發生分離，不利于農業生產。從轉基因青蒿培育純系品種需要很長的時間，而且耗費大量的人力物力，這使得轉基因青蒿的大面積推廣受到了一定的限制。

現有資料中目前已有通過微不定芽技術快速繁殖轉基因青蒿植株的方法。然而，微不定芽技術快速繁殖轉基因青蒿植株需要經轉基因青蒿外植體的脫毒，轉基因青蒿微不定芽的誘導，轉基因青蒿微不定芽的伸長，轉基因青蒿不定芽的生根以及轉基因青蒿再生植株的移栽等多個步驟，過程較為復雜，其中多步需要無菌操作，稍有不慎就易引起青蒿外植體污染，致使擴繁失敗。且在轉基因青蒿外植體的脫毒過程中需要使用升汞等劇毒試劑，容易對操作人員身體造成損害，對周圍環境造成污染。

通過水培技術快速繁殖轉基因青蒿，為保持轉基因青蒿的遺傳穩定性，對轉基因青蒿的大面積推廣、保障充足優質的青蒿種苗、提高青蒿素的產量具有重要意義。且可以克服現有轉基因青蒿水培擴繁技術中種種弊端，省時，低耗，是一種極具應用前景的生物技術。目前尚未發現與本發明主題所提及的采用水培技術快速繁殖轉基因青蒿的相關報道。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種采用水培技術快速繁殖轉基因青蒿的方法，通過水培培養液的配方和水培快速擴繁的方法，建立了用水培技術快速繁殖轉基因青蒿的方法，能夠在短時間內繁殖出大量的轉基因青蒿苗，并且保持轉基因青蒿的遺傳穩定性，對于轉基因青蒿的大面積推廣、保障充足優質的青蒿種苗、提高青蒿素的產量具有重要意義。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明通過將轉基因青蒿外植體置于水培誘導培養液中避光培養得到不定根后移栽到移栽基質中，通過馴化獲得轉基因青蒿植株。

所述的轉基因青蒿外植體是指：含青蒿內源基因的植物雙元表達載體轉入根癌農桿菌(如EHA105，為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為Gambar?1)，在根癌農桿菌介導下，再經過外植體的預培養，農桿菌與外植體的共培養，抗性再生植株的篩選和轉基因青蒿植株的PCR檢測后所得到轉基因陽性植株。

所述的水培誘導培養液的組分為：1g/L全水溶性肥料(花無缺，20-20-20+TE，通用肥)以及10mg/L吲哚乙酸(IAA)，余量為水。