[發明專利]一種表達苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制備方法

有效

• 申請號: 201110339604.5
• 申請日: 2011-11-01
• 公開（公告）號: CN102358889A
• 公開（公告）日: 2012-02-22
• 發明（設計）人: 牛春;周敏毅;劉金毅;程永慶
• 申請（專利權）人: 北京三元基因工程有限公司;北京畢艾歐科技發展有限責任公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01
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技術領域

本發明一般的涉及乳酸乳球菌制品的制備方法，特別的涉及表達苯丙氨酸解 氨酶的乳酸乳球菌制品的制備方法。

背景技術

苯丙氨酸(Phenylalanlne，Phe)是人體必需的一種氨基酸，正常人從飲食中 攝入及體內再循環的苯丙氨酸，除少部分被直接利用外，大部分在肝臟的苯丙氨 酸羥化酶(Phenylalanine?hydroxylase，PAH)的作用下轉化成為酪氨酸后被利用。 患有常染色體隱性遺傳病——苯丙酮尿癥(Phenylketonuria，PKU)的患者，由于 苯丙氨酸羥化酶基因缺陷，導致肝臟的PAH酶活性降低或缺失，無法將苯丙氨酸 轉化成為酪氨酸，致使苯丙氨酸通過其他途徑轉化為苯丙酮酸、苯乙酸、苯乳酸 等。這些非正常代謝產物在血、腦脊液和其他組織中大量積累，對各種組織特別 是腦組織造成不可逆損傷。PKU患者的主要臨床表現是智力低下，癲癇發作和黑 色素減少。

目前國際上通用的治療PKU方法是低苯丙氨酸飲食控制療法。該方法需從患 者一出生起即給予低苯丙氨酸含量的特制的或人工合成的奶粉或食物，同時嚴格 限制正常食物的攝入，并且根據各生長發育階段和個體的差異隨時調整飲食控制 量，直至智力發育基本成熟的年齡，即17-18歲。由于苯丙氨酸在日常飲食中普 遍、大量存在，飲食控制難度極大且控制過程容易造成患兒其它必需氨基酸的攝 入不足，從而引起患兒體質下降、生長發育遲滯等副作用。而特制的人工合成的 低苯丙氨酸食品品種少、口感差、價格昂貴，實際應用中更使患者由于常年無法 食用正常飲食而極其痛苦，因此少有患者能堅持此種飲食從而控制苯丙氨酸攝入 量達十幾年者，因此極大地影響了治療效果。國際上于上世紀80年代初開始研究 酶法治療PKU，主要是采用逆轉錄病毒和重組腺病毒載體介導的方法，來實現 PAH在PKU模型小鼠的肝細胞中的表達。但這一方法的主要問題是轉移效率低， 轉移物免疫原性強，外源基因在細胞中只能短期表達，同時存在安全性隱患，因 此至今未見用于臨床的報道。

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine?ammonia-lyase，PAL)廣泛存在于各種綠色 植物和少數微生物中，它可以催化苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸，因此有希望口服該 酶治療PKU。由于植物和酵母等生產的天然PAL量極少，提取成本很高，因此通 過基因工程方法獲取大量PAL成為研究的重點。

《中國病理生理雜志》2000年16卷第1期第12頁公開了一種水稻PAL基因在 大腸桿菌BL21DE3中的表達方法，PAL主要以包涵體形式存在，誘導7小時后其 表達量達到峰值，占菌體總蛋白量的35.43％。但該菌超聲破碎后提取的粗酶比 活力很低，僅為0.46U/g，原因是PAL在生物體外極不穩定。利用該文獻報道的方 法，一方面無法提取得到體外穩定存在的PAL純品，另一方面表達PAL所用的大 腸桿菌為人體致病菌，不能直接口服應用，因此利用該方法表達的PAL無法在臨 床治療PKU中使用。

中國專利02117216.1公開了一種治療PKU的藥物的制備及使用方法，該方法 將PAL基因轉入腸道正常菌中，通過口服該菌，利用其表達的PAL酶在消化道內 將苯丙氨酸轉化為肉桂酸，從而降低食物來源中的苯丙氨酸進入血液的量，以達 到治療PKU的同時保持較正常飲食的目的。

《生物工程學報》2002年18卷第6期第713頁公布了利用上述專利方法在乳酸 乳球菌(L.lactis)NICE系統中表達歐芹PAL的方法，其使用翻譯融合型載體p (NZ8048-PAL)₁和轉錄融合型載體p(NZ8048-PAL)₂在乳酸乳球菌中表達歐 芹PAL，表達量分別占總蛋白的5.16％和2.76％。該方法的明顯缺陷在于乳酸乳 球菌的發酵量和乳酸乳球菌中表達產物的含量均很低，造成最終發酵獲得的PAL 總水平低，因此成本極高，限制了其實際臨床應用。