[發(fā)明專利]天然絲氨酸蛋白酶抑制劑的純化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110339033.5
• 申請(qǐng)日: 2011-11-01
• 公開（公告）號(hào): CN102372777A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉曼;陳昊;張耀洲;陳劍清;舒特俊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 特菲(天津)生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/81
• 分類號(hào): C07K14/81;C07K1/14
• 代理公司: 北京匯澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11228
• 代理人: 閆立德

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于一種天然絲氨酸蛋白酶抑制劑的純化方法。

背景技術(shù)

蠶蛹是蠶蛾科昆蟲家蠶的蠶繭緇絲后留下的蛹體。其來源廣泛，被認(rèn)為是人類的一種新營(yíng)養(yǎng)源，是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的“作為普通食品管理的食品新資源名單”中唯一的昆蟲類食品。蠶蛹具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素。其中所含的絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin，縮寫SP)，可作為蛋白酶抑制劑參與凝血反應(yīng)、纖維溶解、血管生成、補(bǔ)體激活、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)等。還有少數(shù)執(zhí)行非抑制功能：作為激素轉(zhuǎn)運(yùn)分子、分子伴侶和腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。它們?cè)谌梭w內(nèi)多種生理體系中起關(guān)鍵性的調(diào)控作用，是維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素。但目前，市場(chǎng)上基本還未出現(xiàn)以蠶蛹中有效成分作為藥物開發(fā)的產(chǎn)品，缺乏天然絲氨酸蛋白酶抑制劑的純化方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)一種天然絲氨酸蛋白酶抑制劑的純化方法，利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有藥用價(jià)值的天然絲氨酸蛋白酶抑制劑，該方法操作簡(jiǎn)便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然絲氨酸蛋白酶抑制劑可作為保健藥物，無毒副作用。

為此，本發(fā)明的包括下步驟：

(1)蠶蛹預(yù)處理，將新鮮蠶蛹與4℃預(yù)冷的50mM磷酸緩沖液，pH7.4，按1∶1加入到榨汁機(jī)中勻漿30秒，在冰上冰浴5分鐘，繼續(xù)勻漿，重復(fù)三次，使蠶蛹中的蛋白充分溶解；將勻漿轉(zhuǎn)移到離心杯中，4℃，每分鐘15000轉(zhuǎn)，離心20分鐘，取上清液，上清液過九層紗布過濾除去油脂，重復(fù)離心和過濾步驟三次；收集過濾后的上清液，4℃，每分鐘15000轉(zhuǎn)，離心20分鐘，上清液用0.45μm濾膜真空抽濾，4℃保存；

(2)天然絲氨酸蛋白酶抑制劑的初步分離純化，將上清液置于50℃恒溫水浴30分鐘，再置離心機(jī)每分鐘15000轉(zhuǎn)，離心20分鐘，取上清；

(3)天然絲氨酸蛋白酶抑制劑的分離純化，將上清液置于100℃恒溫水浴30分鐘，再置離心機(jī)每分鐘15000轉(zhuǎn)，離心20分鐘，取上清，再重復(fù)該步驟數(shù)次，直至100℃恒溫水浴無沉淀析出，即可得到天然絲氨酸蛋白酶抑制劑。

所述的步驟(3)中的數(shù)次為3至5次。上述方法實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有藥用價(jià)值的蠶蛹中天然絲氨酸蛋白酶抑制劑，該方法操作簡(jiǎn)便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然絲氨酸蛋白酶抑制劑可作為保健藥物，無毒副作用。

將用本發(fā)明方法制成的抑制劑使用明膠-聚丙烯酰胺凝膠活性染色法進(jìn)行活性檢測(cè)。抑制劑超濾濃縮后跑非變性明膠-聚丙烯酰胺凝膠，將膠條割下，分別于25μg/ml胰蛋白酶，pH8.0，37℃水浴的條件下，酶解30分鐘、60分鐘、2小時(shí)、3小時(shí)、12小時(shí)，再將酶解后的膠條用考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果證明所得到的抑制劑酶解3小時(shí)后仍保持其生物活性。

具體實(shí)施方式

一種天然絲氨酸蛋白酶抑制劑的純化方法。包括下步驟：(1)蠶蛹預(yù)處理，將新鮮蠶蛹與4℃預(yù)冷的50mM磷酸緩沖液，pH7.4，按1∶1加入到榨汁機(jī)中勻漿30秒，在冰上冰浴5分鐘，繼續(xù)勻漿，重復(fù)三次，使蠶蛹中的蛋白充分溶解；將勻漿轉(zhuǎn)移到離心杯中，4℃，每分鐘15000轉(zhuǎn)，離心20分鐘，取上清液，上清液過九層紗布過濾除去油脂，重復(fù)離心和過濾步驟三次；收集過濾后的上清液，4℃，每分鐘15000轉(zhuǎn)，離心30分鐘，上清液用0.45μm濾膜真空抽濾，4℃保存。(2)天然絲氨酸蛋白酶抑制劑的初步分離純化，將上清液置于50℃恒溫水浴30分鐘，再置離心機(jī)每分鐘15000轉(zhuǎn)，離心20分鐘，取上清。(3)天然絲氨酸蛋白酶抑制劑的分離純化，將上清液置于100℃恒溫水浴30分鐘，再置離心機(jī)每分鐘15000轉(zhuǎn)，離心20分鐘，取上清，再重復(fù)該步驟3至5次，直至100℃恒溫水浴無沉淀析出，即可得到天然絲氨酸蛋白酶抑制劑。將得到的天然絲氨酸蛋白酶抑制劑無菌分裝，-50℃冷凍干燥，制成凍干粉。檢測(cè)用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)樣品，在42kDa處有目的蛋白的條帶。

總之，本發(fā)明能利用蠶蛹作為原料，通過分離純化獲得具有藥用價(jià)值的天然絲氨酸蛋白酶抑制劑，該方法操作簡(jiǎn)便，且產(chǎn)量高，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，提純的天然絲氨酸蛋白酶抑制劑可作為保健藥物，無毒副作用。