[發(fā)明專利]MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測引物及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110338973.2
• 申請日: 2011-11-01
• 公開（公告）號: CN102329886A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張奕;王校;傅詠南
• 申請（專利權(quán)）人: 上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/445
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）中耐消毒劑QacA基因攜帶情況的檢測引物及檢測方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

金黃色葡萄球菌的qac?轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)屬于主要易化子超家族(major?facilitator?superfamily，MFS)?，由QacA?和qacR?基因構(gòu)成，由質(zhì)粒編碼，QacA?是多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因介導(dǎo)對親脂性消毒劑季胺類化合物(quaternary?ammonium?compounds，Qac)?外排而命名；QacR?是188?個(gè)氨基酸的多藥結(jié)合蛋白，屬TerR?類轉(zhuǎn)錄抑制蛋白。無誘導(dǎo)底物時(shí)，QacR?結(jié)合在QacA?啟動(dòng)子下游的假回文序列(?IR1)?上，抑制QacA?的轉(zhuǎn)錄。因?yàn)樵摷倩匚男蛄?IR1)?與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)重疊，?所以推測QacR?通過結(jié)合IR1結(jié)構(gòu)而阻止RNA?聚合酶2啟動(dòng)子復(fù)合體形成有效的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)而抑制QacA?的轉(zhuǎn)錄，并不是通過阻止RNA?聚合酶的結(jié)合。QacA基因表達(dá)多種化合物外排泵蛋白，細(xì)菌獲得QacA基因可表現(xiàn)為對胺類(如苯扎溴銨)?、胍類(如氯己定)?、腙類消毒劑耐藥，由此在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了極大的危險(xiǎn)因素。

目前檢測QacA基因攜帶情況的方法主要有PCR后瓊脂糖凝膠電泳、測序。凝膠電泳法成本低、易操作，但靈敏度低，容易出現(xiàn)假陰性；測序是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但測序技術(shù)步驟繁瑣、耗時(shí)長、容易污染。本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，應(yīng)用具有分辨率更高、雜交特異性更強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)的Taqman-MGB探針，不僅檢測速度快，全部反應(yīng)在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免了交叉污染，且自動(dòng)化程度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，使結(jié)果判讀更直觀。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）中耐消毒劑QacA基因攜帶情況的PCR檢測引物及檢測方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一組MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測引物，其特征在于，包括：

QacA基因正向引物：?5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；

QacA基因反向引物：?5′-ccaattccggaaggtaacac-3′。

本發(fā)明還提供了一種MRSA中QacA基因攜帶情況的檢測方法，其特征在于，具體步驟為：

第一步：取經(jīng)培養(yǎng)后鑒定為MRSA陽性的臨床樣本分離株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為檢測樣品；取不攜帶QacA基因的金黃色葡萄球菌菌株，高溫滅活，提取樣本DNA，作為陰性對照品；人工合成QacA序列，構(gòu)建攜帶QacA基因的重組質(zhì)粒為陽性對照品；

第二步：用無菌水配制濃度為5～15umol/L?的QacA基因正向引物溶液，濃度為5～15umol/L?的QacA基因反向引物溶液以及濃度為5～15umol/L?的QacA基因檢測探針溶液，其中，引物和探針序列如下：

?QacA基因正向引物：?5′-ggttgtggaagaactttctcctt-3′；

QacA基因反向引物：?5′-ccaattccggaaggtaacac-3′；

QacA基因探針：FAM-atggtgtttgcac-MGBNFQ；

????第三步：在每一個(gè)PCR反應(yīng)孔中加入PCR?Master?Mix?10～15ul，第二步所得的QacA基因正向引物溶液0.1～1ul，QacA基因反向引物溶液0.1～1ul，QacA基因檢測探針溶液0.1～1ul，第一步所得的檢測樣品、陰性對照品或陽性對照品0.1～1ul，用滅菌重蒸餾水補(bǔ)足25ul；在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40～60℃保溫1～3分鐘，80～100℃保溫1～3分鐘，再運(yùn)行30～50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在80～100℃保溫10～20秒再在50～70℃保溫0.5～1.5分鐘；

????第四步：用軟件SDS2.2進(jìn)行結(jié)果分析，PCR結(jié)果呈S形曲線即為攜帶QacA基因。

本發(fā)明是對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中是否還有耐消毒劑QacA基因的檢測，細(xì)菌一旦獲得此基因即可對現(xiàn)用的消毒劑耐受，使消毒劑失效，通過檢測了解細(xì)菌中QacA基因的攜帶情況，有利于對含有耐消毒劑基因的菌株的監(jiān)控，防止菌株繼續(xù)流行，同時(shí)從科研角度對其耐藥機(jī)理的進(jìn)一步了解還有利于新的滅菌制劑的研制開發(fā)。

本發(fā)明檢測率高、可重復(fù)性強(qiáng)，檢測速度快，全部反應(yīng)在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免了交叉污染，且自動(dòng)化程度高，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控，提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，使結(jié)果判讀更直觀。

附圖說明