[發(fā)明專利]二氧化鈦納米棒陣列嫁接RGD生物信號(hào)分子的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110338972.8
• 申請(qǐng)日: 2011-11-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102327649A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翁文劍;劉洋;程逵;杜丕一;韓高榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): A61L27/50
• 分類(lèi)號(hào): A61L27/50;A61L27/28
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 韓介梅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種在二氧化鈦納米棒陣列表面嫁接RGD生物信號(hào)分子的方法。

背景技術(shù)

二氧化鈦因?yàn)槠淞己玫姆€(wěn)定性和優(yōu)異的生物相容性和無(wú)毒性被廣泛應(yīng)用于骨組織修復(fù)材料。另一方面，二氧化鈦納米棒陣列可以提供更多的接觸點(diǎn)，即更多的表面區(qū)域來(lái)與生命機(jī)體識(shí)別并結(jié)合，具有更好的生物學(xué)響應(yīng)性（Hydrothermal?growth?of?rutile?TiO2?nanorod?films?on?titanium?substrates，Thin?Solid?Films.?Volume?519,?Issue?15,?31?May?2011,?p.4634-4640）。

細(xì)胞識(shí)別是指細(xì)胞膜表面受體和細(xì)胞外基質(zhì)中配體的相互識(shí)別，在種植體和生物有機(jī)體整合過(guò)程中起著重要作用。調(diào)控細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間細(xì)胞識(shí)別的主要是整聯(lián)蛋白，它存在于細(xì)胞膜表面，會(huì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的各種信號(hào)產(chǎn)生響應(yīng)，同時(shí)也可以反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的各種信息，決定了細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的傳遞和交換，最終影響細(xì)胞的粘附、遷移、增殖、分化和死亡等過(guò)程。

為了增強(qiáng)生物種植體和生命有機(jī)體的相互識(shí)別和結(jié)合，可在傳統(tǒng)的生物材料上添加被整聯(lián)蛋白識(shí)別的配體，使得細(xì)胞識(shí)別并且接受種植體為“自體”的一部分，誘導(dǎo)促進(jìn)骨整合和骨形成能力。Arg-Gly-Asp，即為RGD序列，是存在于纖連蛋白和某些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白肽鏈中的“精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)”三肽序列，可被一些整聯(lián)蛋白所識(shí)別，并與之結(jié)合，能有效地促進(jìn)細(xì)胞對(duì)生物材料的粘附。曹馨等（口腔醫(yī)學(xué)研究２０１１年４月第２７卷第４期）利用不同的方法在二氧化鈦納米管表面構(gòu)建RGD生物信號(hào)分子。Patrick?H.?Blit等人（JOURNAL?OF?BIOMEDICAL?MATERIALS?RESEARCH?A.?15?SEP?2010?VOL?94A,?ISSUE?4,?p.1226-1235）已說(shuō)明表面修飾RGD的多孔材料促進(jìn)了細(xì)胞的粘附和增殖，Hyun?Suk?Seo等人（Applied?Surface?Science.?257?(2010)?p.?596–602）表明在鈦金屬表面修飾RGD有利于成骨細(xì)胞分化和骨形成。Ganesan?Balasundaram等人（Journal?of?Biomedical?Materials?Research?Part?A.?6?July?2007.?p.447-453）通過(guò)陽(yáng)極氧化在鈦金屬表面構(gòu)建納米管結(jié)構(gòu)，且嫁接BMP-2來(lái)增強(qiáng)骨形成。但是，各種手段的嫁接RGD基本都在種植體表面，未深入材料內(nèi)部，且仍未見(jiàn)利用二氧化鈦納米棒的多作用點(diǎn)和表面修飾RGD雙重手段深化促進(jìn)生物種植體和生物有機(jī)體的相互識(shí)別和結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種在二氧化鈦納米棒陣列上嫁接RGD生物信號(hào)分子的方法。

本發(fā)明首先是通過(guò)利用硅烷偶聯(lián)劑將二氧化鈦納米棒陣列和硅烷相連，末端用氨基修飾，接著再通過(guò)酰胺反應(yīng)將RGD嫁接到二氧化鈦納米棒陣列的表面，最終形成RGD生物信號(hào)分子表面修飾的納米棒陣列。

本發(fā)明的二氧化鈦納米棒陣列嫁接RGD生物信號(hào)分子的方法，其具體步驟如下：

1）將納米棒陣列基板用去離子水清洗后，在0.02-0.05M/L?NaOH溶液中浸泡30分鐘，再次用去離子水清洗，紫外照射30分；

2）將500～1000ul?3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解在100ml乙醇中，攪拌下放入37℃水浴中，并放入步驟1）處理的納米棒陣列基板反應(yīng)4小時(shí)后，用乙醇清洗，放入烘箱中干燥；

3）將0.3g?1-乙基-（二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽溶于100ml?MES緩沖液中，攪拌下放入37℃水浴中，并放入步驟2）處理的納米棒陣列基板反應(yīng)6小時(shí)后，依次用MES緩沖液和PBS緩沖液清洗；

4）將經(jīng)步驟3）處理的納米棒陣列基板放入100～300ug/ml的Arg-Gly-Asp?/PBS緩沖液中，在37℃空氣氣氛中靜置4小時(shí)后，取出依次用PBS緩沖液和去離子水沖洗，冷凍干燥。

本發(fā)明中，所述的納米棒陣列基板為純鈦金屬基板或者光滑平整的硅基板。納米棒陣列基板可以采用CN101973582A公開(kāi)的方法制備得到。

本發(fā)明制備過(guò)程中，步驟1）將納米棒陣列基板浸泡在NaOH溶液中進(jìn)行堿處理，是利用化學(xué)反應(yīng)對(duì)基板表面除去酸性雜質(zhì)離子，以免雜質(zhì)對(duì)后續(xù)反應(yīng)造成影響。