[發(fā)明專利]鈉氫泵蛋白及其編碼基因和它們的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110338562.3
• 申請日: 2011-10-31
• 公開（公告）號: CN103087159A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬延和;翟磊;薛燕芬
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;A01H5/00
• 代理公司: 北京潤平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11283
• 代理人: 王浩然;王鳳桐

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鈉氫泵蛋白，還涉及鈉氫泵蛋白的編碼基因，以及含有鈉氫泵基因的重組載體和細(xì)胞，以及鈉氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細(xì)胞在培育具有耐鹽性和耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

鈉氫泵(Na⁺/H⁺antiporter)是細(xì)胞中負(fù)責(zé)Na⁺/H⁺交換的一種跨膜運輸?shù)鞍祝瑥V泛存在于細(xì)菌、人和高等植物的質(zhì)膜及許多真核生物細(xì)胞器的膜中。質(zhì)膜H⁺-ATPase用水解ATP的能量把H⁺從細(xì)胞質(zhì)中泵出細(xì)胞，產(chǎn)生跨質(zhì)膜的H⁺電化學(xué)勢梯度，提供能量，驅(qū)動質(zhì)膜上的鈉氫泵蛋白，使H⁺順其電化學(xué)勢進入細(xì)胞，同時Na⁺逆其電化學(xué)勢排出細(xì)胞。鈉氫泵蛋白通過Na⁺外排來保持細(xì)胞內(nèi)的低Na⁺水平和pH值的穩(wěn)定，是生物細(xì)胞耐受鹽堿的關(guān)鍵因子，另外它在細(xì)胞器的發(fā)生及離子均衡過程中，還執(zhí)行體積和滲透調(diào)節(jié)的功能，是保持細(xì)胞離子均衡的關(guān)鍵因子。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的發(fā)明人基于對鈉氫泵的分子生物學(xué)研究，意外地發(fā)現(xiàn)從嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC?NO.0369)中得到了一種鈉氫泵蛋白及其編碼基因，另一方面還提供了含有鈉氫泵基因的重組載體和細(xì)胞，以及鈉氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細(xì)胞在培育具有耐鹽性和耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種鈉氫泵蛋白，其中，該鈉氫泵蛋白具有SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列，或者該鈉氫泵蛋白具有將SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鈉氫泵蛋白活性的氨基酸序列。

本發(fā)明還提供了一種鈉氫泵基因，其中，該基因具有SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

另外，本發(fā)明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有本發(fā)明提供的鈉氫泵基因。

本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有本發(fā)明提供的鈉氫泵基因。

本發(fā)明還提供了得到的鈉氫泵蛋白及其編碼基因、含有該基因的重組載體及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育具有耐鹽性和耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。

鈉氫泵蛋白在耐鹽堿植物培育等方面具有重要的應(yīng)用潛力。通過克隆得到鈉氫泵基因，并通過轉(zhuǎn)基因的操作將微生物來源的鈉氫泵基因?qū)氲街参锛?xì)胞中，獲得耐鹽堿性提高的轉(zhuǎn)基因植株成為可能。

附圖說明

圖1顯示了重組載體pUC18-Bsp165-NhaC導(dǎo)入的大腸桿菌K12(pUC18-Bsp165-NhaC)的耐堿性的測定結(jié)果，其中，將重組載體pUC18-Bsp165-NhaC導(dǎo)入的大腸桿菌K12(pUC18-Bsp165-NhaC)分別接種到pH為8.0、8.5、9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N?NaOH調(diào)節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中(100μg/ml氨芐青霉素)，培養(yǎng)12小時后測定OD₆₀₀，以導(dǎo)入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。

圖2顯示了重組載體pUC18-BspN165-NhaC導(dǎo)入的大腸桿菌K12(pUC18-BspN165-NhaC)的耐鹽性的測定結(jié)果，其中，將重組載體pUC18-BspN165-NhaC導(dǎo)入的大腸桿菌K12(pUC18-BspN165-NhaC)分別接種到含有0、2％、4％、6％和8％的NaCl的LB液體培養(yǎng)基中(100μg/ml氨芐青霉素)，培養(yǎng)12小時后測定OD₆₀₀，以導(dǎo)入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。

圖3顯示了鈉氫泵缺失的大腸桿菌KNabc以及導(dǎo)入重組載體pUC18-Bsp165-NhaC的KNabc(pUC18-Bsp165-NhaC)耐堿性的測定結(jié)果，其中，將導(dǎo)入重組載體pUC18-Bsp165-NhaC的KNabc(pUC18-Bsp165-NhaC)和鈉氫泵缺失的大腸桿菌KNabc分別接種到pH為8.0、8.5、9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N?NaOH調(diào)節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時后測定OD₆₀₀，以大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。