[發明專利]一種鑒定西施舌種類的AFLP選擇性引物及方法

有效

• 申請號: 201110337023.8
• 申請日: 2011-10-31
• 公開（公告）號: CN102373279A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 黎中寶;王展林
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市誠得知識產權代理事務所 35209
• 代理人: 方惠春

技術領域

本發明涉及生物檢測鑒定技術，尤其涉及一種西施舌種類的AFLP鑒定引物和方法。?

背景技術

西施舌俗稱“海蚌”，個體較大，營養豐富，肉質細嫩，滋味鮮美，可與海參、鮑魚媲美，是一種經濟價值很高的名貴海產貝類。除此之外，西施舌還具有極高的醫療保健價值，是一種高蛋白、低脂肪、低膽固醇的食物，具有降低尿糖的功效。近年來，隨著市場需求的增加，野生西施舌資源由于濫捕而銳減，目前，西施舌的養殖已經在試驗之中，預計今后也將逐步得到發展。

西施舌在我國沿海均有分布，但是價格卻差別很大，福建與廣西沿海的西施舌由于環境特殊，所產的西施舌品質、風味更勝其它地區產的西施舌，價格上高出許多，有研究已經證明福建、廣西沿海的西施舌與其它地區的西施舌已經分化成了兩個亞種。新鮮的或未經加工的西施舌，一般人很難從其貝殼的形態加以識別，長期從事西施舌相關行業的人士或可從外形分辨，但是經過加工的產品則無法從形態上判斷是產于哪個海區的西施舌。這樣很容易出現一些以次充好后高價出售的現象。為此需要一種靈敏可靠的從加工品鑒別原料西施舌種類的技術。

不同種生物其基因序列間通常存在著比較固定的差異，因此可以根據基因組DNA序列的不同進行物種鑒別，這種方法不受生物生長發育狀態的影響，鑒別的準確性很高。其中最可靠的方法是克隆出某個基因或DNA片段進行測序，但是測序的操作復雜，成本也比較高。對于魚類已經有人建立了抽提線粒體DNA，用多種限制性內切酶對線粒體DNA進行切割，根據酶切結果的差異識別與鑒定魚類加工品的原材料魚種的方法，但是這種方法需要較多的組織樣品來抽提線粒體DNA。PCR技術是一種非常靈敏的體外DNA擴增技術，它同時具有很高的特異性，通過設計適宜的引物和控制適宜的反應條件，利用它可以鑒別出受檢DNA上微小的序列差異，已經被廣泛應用到生命科學研究眾多領域，及至刑偵、法醫鑒定領域。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提供一種鑒定西施舌種類的AFLP選擇性引物及鑒定方法，為形態上不便于鑒別的西施舌進行種類的鑒定。

為解決上述問題，本發明提供一組引物，其序列是SEQ?NO:1和SEQ?NO:2；和或SEQ?NO:3和SEQ?NO:4；和或SEQ?NO:5和SEQ?NO:6。

E-ACA/M-CGT：EcoR?I選擇性引物：5’-GACTGCGTACCAATTCACA-3’（?SEQ?NO:1）

MseI選擇性引物：5’-GATGAGTCCTGAGTAACGT-3’?（?SEQ?NO:2）

E-ACT/M-CGT：EcoR?I選擇性引物：5’-GACTGCGTACCAATTCACT-3’?（?SEQ?NO:3）

MseI選擇性引物：5’-GATGAGTCCTGAGTAACGT-3’?（?SEQ?NO:4）

E-AGA/M-CGT：EcoR?I選擇性引物：5’-GACTGCGTACCAATTCAGA-3’?（?SEQ?NO:5）

MseI選擇性引物：5’-GATGAGTCCTGAGTAACGT-3’?（?SEQ?NO:6）

為解決上述問題，本發明提供一種鑒定方法，其具體步驟為：

提取西施舌DNA；所述西施舌DNA可以是來源于西施舌足部的肌肉。

MseⅠ和EcoRⅠ雙酶切所述提取的西施舌DNA得到酶切片斷;

將人工合成的接頭在T4?DNA連接酶作用下連接到所述酶切片斷的兩端，形成帶有接頭的片斷，接頭序列是：SEQ?NO:7和SEQ?NO:8，SEQ?NO:9和SEQ?NO:10；SEQ?NO:7和SEQ?NO:8合成的時候是以DNA雙鏈的形式，形成粘性末端，才能和雙酶切片段在T4連接酶的作用下連接，SEQ?NO:9和SEQ?NO:10同理。

具體為EcoR?I?接頭序列：?5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’（?SEQ?NO:7）

???????????????????????5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’（?SEQ?NO:8）

Mse?I?接頭序列：??5’-GACGTGAGTCCTGAG-3’（?SEQ?NO:9）

????????????????????????5’-TACTCAGGACTCAT-3’（?SEQ?NO:10）