[發明專利]H1N1、PRRSV、O-FMDV四重檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201110336914.1
• 申請日: 2011-10-31
• 公開（公告）號: CN102676691A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 胡萌;王業富
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 薛玲

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種甲型H1N1流感病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒及O型口蹄疫病毒四重同步核酸定量檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

甲型H1N1流感病毒為A型流感病毒，正黏病毒科。新分離的病毒多為絲狀，顆粒呈多形性，直徑為80～120nm。病毒粒子有囊膜與纖突，核衣殼螺旋形對稱。基因組由8條單鏈負義分節段RNA片段組成，分別編碼一到兩種蛋白，具體為PB2編碼PB2聚合酶，PB1編碼PB1聚合酶，PA編碼PA聚合酶，HA編碼血凝素HA，NP編碼核蛋白NP，NA編碼神經氨酸酶NA，M編碼基質蛋白M1、M2，NS編碼非結構蛋白NS1、NS2。每節段兩端均有末端重復序列，所有節段3’端核苷酸序列相同。5’端有與3’端核苷酸序列互補的保守區段和重復序列。整個基因組約13.5kp。M為流感病毒的分類依據之一，根據M及NP，流感病毒被分為A、B、C三種類型，而HA則為A型流感病毒的進一步分類依據之一，根據HA及NA抗原抗性，可將A型流感病毒共分為16中HA亞型及9中NA亞型，因此理論上A型流感病毒存在135中亞型可能性。通過M鑒別A型，HA鑒別H1，理論上可將H1N1特異性的檢測出來。確定目標基因及其相對保守的序列，合成相應的引物探針，達到特異性的檢測甲型H1N1流感病毒的目的。不僅如此，M基因及HA基因編碼的蛋白均為功能性蛋白，如M蛋白可裂解為M1及M2，M1蛋白同囊膜結合，其固定支撐作用，而M2蛋白則形成四聚體分部于囊膜內部，可調節病毒pH值從而有利于病毒侵染過程中的基因組釋放，M2對病毒復制過程中調節宿主細胞高爾基體的pH值也具有很大作用。HA為跨膜蛋白，其主要成分位于膜外，以唾液酸(N-乙-神經氨酸)為受體，通過膜融合，介導病毒顆粒進入細胞。因此，研究該基因片段對進一步深入的研究病毒的致病機理至關重要。甲型H1N1流感病毒雖然是一種新型病毒，但是病人感染這種病毒后的表現癥狀卻和一般的流感基本相同，因此，很難從癥狀上判斷到底是不是感染了甲型H1N1流感。其癥狀與普通感冒幾乎是一樣的。從臨床癥狀上基本無法區別，必須得通過實驗室的檢測，才能確診。本發明通過設計針對Matrix基因及血凝素H1基因的LNA探針及引物，以此來特異性檢測檢測甲型H1N1流感病毒，靈敏度高，特異性強，可大批量檢測。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，俗稱豬藍耳病毒，為套式病毒目，動脈炎病毒科、屬，分血清型有美洲型及歐洲型兩種，兩型間核苷酸序列差異較大，而對型內而言，歐洲型較為保守，美洲型變異較大，我國目前流行的為美洲型。PRRSV病毒粒子有囊膜及纖突，直徑50～60nm，基因組為不分節段的單股正義RNA組成，含8個開放閱讀框，點突變率高，存在基因重組現象。目前針對高致病性豬藍耳病毒的核酸檢測，目標基因大致為RNA?Pol，ORF5、6、7區域，根據以上H1N1敘述的理由，選定GP5為目標基因，GP5為PRRSV的主要結構蛋白，也是重要的功能性蛋白，該蛋白含病毒的6個抗原決定簇，其中一個為血清型特異性線性中和決定簇，能在體外中和抗體，是病毒的主要免疫性保護性抗原。良好的免疫原性及反應原性決定了該核酸及蛋白在疫苗研究等方面的重要意義。PRRS是危害養豬業最嚴重的疾病之一，除疾病本身造成危害外，更重要的是PRRSV感染機體，導致機體免疫抑制，致使很多其它病原體(PCV2、鏈球菌、APP和副豬嗜血桿菌、CSFV等)繼發感染或混合感染，從而導致豬場很高的死亡率和較大的經濟損失。根據流行病學、臨床癥狀和病理變化可對高致病性藍耳病做出初步診斷。但確診需要實驗室進行病毒分離鑒定或用分子生物學檢測方法，本研究通過檢測GP5來診斷PRRSV。