[發明專利]酶法轉化甘草酸生成甘草次酸的方法

無效

• 申請號: 201110336688.7
• 申請日: 2011-10-31
• 公開（公告）號: CN102337319A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 宋新波;黃鴻志;馬百平;余河水;張潔;李薇
• 申請（專利權）人: 天津中一制藥有限公司
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12R1/66
• 代理公司: 北京紐樂康知識產權代理事務所 11210
• 代理人: 田磊

發明領域

本發明涉及一種轉化甘草酸生成甘草次酸的生物方法，即用微生物產生的酶進行生物轉化。

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背景技術

甘草酸（Glycyrrhizic?acid，GL）是甘草中的主要活性物質^[1]。甘草酸具有一定的藥理活性，如具有肝臟保護^[2]，抗病毒^[3]和抗癌^[4]的作用。甘草酸在食品上也有著廣泛的用途。甘草酸具有較高的甜味，它的甜味是蔗糖的170-200倍，而且它有特殊的風味。因此，它在食品行業中被用作為甜味劑、增香劑。例如，我國國標2760-86規定允許甘草酸作為罐頭、調味品、糖果、餅干、蜜餞等的甜味劑，用量根據正常生產需要而定^[5,?6]。在日本，甘草酸也被用于食品中作為甜味劑和增香劑^[7]。

另一方面，甘草酸也被作為前體化合物，用于其它化合物的合成。例如，甘草酸去掉兩個葡萄糖醛酸基，生成甘草次酸（Glycyrrhetinic?acid，GA）^[8-10]。甘草次酸沒有甜味，但是其藥理活性比甘草酸強，具有很強的肝保護作用，抗病毒活性及抗腫瘤活性^[8]。目前，利用甘草酸生成甘草次酸主要有兩種方法，即化學方法和生物轉化方法。化學方法通過酸、堿作用，水解去掉甘草酸的糖基，從而生成甘草次酸^[11]。但是，由于這種方法要用到大量的酸、堿試劑，對環境污染較為嚴重。而且強酸、強堿對甘草酸結構也會產生一定的破壞作用，從而導致甘草次酸的最終得率下降。?例如，在申請專利201010192841.9中^[11]，應用化學方法制備甘草次酸的得率是60％～90％。因此，人們開始嘗試用生物轉化方法生產甘草次酸。但是，就目前有關報道，用微生物轉化甘草酸生成甘草次酸的效率還是比較低。一方面，是因為這些微生物分泌的能夠轉化甘草酸生成甘草次酸的酶量比較少，另一方面，是因為這些酶的活力比較低。導致了轉化甘草酸的效率比較低，至今未見生物轉化方法產業化應用。因此，尋找能夠高效水解甘草酸的微生物就至關重要。

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發明內容

本發明目的是利用生物技術，提供一種酶法轉化甘草酸生成甘草次酸的方法，其轉化率高，適合甘草次酸是生產制備。

我們研究發現一些真菌可以將甘草酸水解生產甘草次酸。利用馬鈴薯瓊脂等斜面培養基進行真菌培養；再將真菌接種到YPG等液體培養基中發酵產生酶；將酶液加入到甘草酸溶液中，進行轉化；將轉化生產的甘草次酸進行適當分離純化，即可得到甘草次酸。

具體地，本發明涉及一種酶法生物轉化甘草酸生成甘草次酸的方法，其特征是：采用微生物產生的甘草酸水解酶，對甘草酸進行水解，生成甘草次酸。

優選地，在本發明的方法中，甘草酸水解酶通過將真菌接種到YPG液體培養基中發酵產生酶。

優選地，在本發明的方法中，所述的真菌利用馬鈴薯瓊脂斜面培養基進行培養。

優選地，本發明的方法包括下述步驟：

a)利用馬鈴薯瓊脂等斜面培養基進行真菌培養；b)將真菌接種到YPG液體培養基中發酵產生酶；c)將酶液加入到甘草酸溶液中，進行轉化；d)任選地，將轉化生產的甘草次酸進行適當分離純化，得到甘草次酸。

優選地，在本發明的上述各方面，所述的甘草酸水解酶由真菌Aspergillus?phoenicis產生。

優選地，在本發明的各方法中，利用甘草酸水解酶對甘草酸進行水解的反應中，作為酶作用的底物的甘草酸的純度是20%-85%，酶水解作用溫度是30-60℃，pH范圍是2.5-7.0。

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實施例

實施例一：

配制馬鈴薯瓊脂斜面培養基。首先制備馬鈴薯浸汁：將200?g去皮馬鈴薯切成小塊，加適量水煮沸后80℃浸泡1?h，紗布過濾，水加至1000?mL。然后配制馬鈴薯瓊脂斜面培養基：馬鈴薯汁100?mL、葡萄糖2?g、瓊脂2?g。于1.06?kg/cm²壓力下121°C濕熱滅菌30?min。

配制液體培養基YPG：酵母提取物5?g，蛋白胨10?g，葡萄糖10?g，瓊脂15?g，加水1升，pH調至6.0。于1.06?kg/cm²壓力下121°C濕熱滅菌30?min。