[發明專利]在競爭性抑制劑保護下用針對氨基的活化聚乙二醇修飾尿酸酶的方法

有效

• 申請號: 201110336104.6
• 申請日: 2011-10-31
• 公開（公告）號: CN103083678B
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 廖飛;楊曉蘭;張純;劉紅博;高昂
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: A61K47/60
• 分類號: A61K47/60;A61K38/44;C12N9/06;A61P19/06;A61P35/00
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1.一種在競爭性抑制劑結合保護下用針對氨基的活化聚乙二醇修飾尿酸酶的方法，其特征在于按如下步驟進行：

(一)、將活化可修飾氨基的聚乙二醇衍生物簡稱為活化聚乙二醇，包括N-羥基琥珀酰亞胺或對硝基苯酚或三氯苯酚活化聚乙二醇羧酸酯、N-羥基琥珀酰亞胺或三氯苯酚或對硝基苯酚活化聚乙二醇碳酸酯；

(二)、將濃度在0.01～0.20mol/L且pH在7.5～9.5間的硼酸鈉緩沖液或濃度在0.01～0.20mol/L且pH在7.0～8.5間磷酸鈉緩沖液，在2度到25度之間恒溫5到120分鐘；當所用緩沖液體積很大時，攪拌緩沖液以快速達到所需溫度；緩沖液的溫度如下設定：如用聚乙二醇羧酸酯的活化形式修飾氨基則緩沖液pH控制在8.0到9.2間且溫度不高于25度，如用聚乙二醇碳酸酯的活化形式修飾氨基則緩沖液pH控制在7.5到9.0間且溫度控制在不高于20度；

(三)、選擇黃嘌呤、氧嗪酸鉀、8-氮雜黃嘌呤這三種尿酸酶競爭性抑制劑中的一種，溶解在步驟(二)恒溫的緩沖液中達到其對擬修飾尿酸酶抑制常數的2倍以上或達到飽和；尿酸酶競爭性抑制劑稱為對尿酸酶進行聚乙二醇修飾的保護劑；將保護劑的緩沖液在相同溫度下恒溫；

(四)、將純化的原核或真核尿酸酶，稱取適量加入到步驟(三)所得含保護劑緩沖液中，溫和攪拌5分鐘到20分鐘，獲得尿酸酶溶液；控制所用尿酸酶的量，使得其濃度在0.5g/L以上而在100g/L以下保證全部溶解，將尿酸酶溶液在相同溫度下恒溫；

(五)、按所用純化尿酸酶的質量、亞基分子量及其每個亞基中所含來自賴氨酸殘基的氨基和N端氨基數量計算單位質量尿酸酶中氨基的摩爾量；按活化聚乙二醇平均分子量和質量，計算活化聚乙二醇摩爾量；稱取適量活化聚乙二醇固體，使其摩爾量達到來自步驟(四)所用尿酸酶的氨基總摩爾量的6倍以上；

(六)、將活化聚乙二醇固體，直接以每批10mg的量，用藥匙分批加入到步驟(四)所得尿酸酶溶液中，邊加邊溫和攪拌；

(七)、在步驟(二)設定的溫度下，溫和攪拌或震蕩反應10分鐘到30小時；將所得溶液對濃度為10～50mmol/L的相同pH緩沖液透析除去競爭性抑制劑得到聚乙二醇修飾的尿酸酶溶液，或進一步超濾濃縮后冷凍干燥得到粉末狀修飾產物。