[發明專利]一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法

無效

• 申請號: 201110334119.9
• 申請日: 2012-03-08
• 公開（公告）號: CN102533834A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 曹豐;王福;田捷;梁繼民;王慎旭
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學;西安電子科技大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務所有限公司 61114
• 代理人: 韓翎

一、技術領域：

本發明涉及一種報告基因系統，尤其是涉及一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其為一種通過構建雙模態成像報告基因系統，來非入侵式監測內源microRNA表達水平的方法。

二、背景技術

???microRNA是一類長度在22個核苷酸（nt）左右的內源性非編碼小分子單鏈RNA，能通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區完全或不完全互補配對，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯。大量科學研究表明，microRNA在一系列的生物學過程如發育、增殖、代謝及凋亡等中都發揮著重要的調節功能。

現今監測microRNA表達水平的傳統方法主要有Norhtern?雜交、原位雜交、實時定量PCR或基因芯片等。然而這些監測方法不僅耗費時間和人力，更為重要的是，它們在操作過程中要求固定或裂解細胞，導致細胞死亡，因而不能在活體狀態下研究microRNA的表達水平以及監測其在生命活動中的調控作用。雖然目前也有報道活體研究microRNA表達的成像技術，但都是基于單一模態的成像技術，不能獲得完整清晰的活體的全部信息。

三、發明內容

本發明的目的在于提供一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其提供了microRNA表達調控相關研究的分子成像報告基因系統，為深入研究microRNA在組織細胞內的表達水平及其對生命活動的調控功能奠定了基礎。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種在體無創監測microRNA表達的雙模態成像報告基因的方法，其特征在于：（1）利用人鈉／碘共同轉運體基因能夠吸收放射性碘而作為報告基因用于核素成像的特性，將hNIS基因克隆到質粒pcDNA3.1多克隆位點上，從而得到質粒pcDNA3.1-hNIS；（2）利用螢光蟲螢光素酶可以作為報告基因用于生物發光成像的特性，將Fluc基因克隆到pcDNA3.1-hNIS上，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得pcDNA3.1-Fluc-hNIS；（3）利用microRNA與靶標mRNA通過堿基互補配對的形式相互作用的特性，將與microRNA-16完全互補配對的三段串聯重復序列克隆到pcDNA3.1-Fluc-hNIS上，從而獲得雙模態成像報告基因pcDNA3.1-Fluc-hNIS-3xmir16TS。

在步驟（1）中，通過PCR擴增全長hNIS基因，然后克隆到pcDNA3.1的HindIII和EcoRI酶切位點之間，從而得到質粒pcDNA3.1-hNIS。

在步驟（2）中，通過PCR擴增全長Fluc基因，然后克隆到pcDNA3.1-hNIS的NheI和HindIII酶切位點之間，使hNIS和Fluc基因能夠融合表達，從而獲得pcDNA3.1-Fluc-hNIS。

在步驟（3）中，通過化學合成與microRNA-16互補配對的三段串聯重復序列，然后克隆到Fluc－hNIS融合基因的下游EcoRV和XhoI之間,從而獲得雙模態成像報告基因pcDNA3.1-Fluc-hNIS-3xmir16TS。

在步驟（1）中，PCR擴增全長hNIS基因，凝膠電泳及膠回收PCR產物，將膠回收產物使用HindIII和EcoRI進行雙酶切，得到hNIS基因雙酶切產物；提取質粒pcDNA3.1，使用HindIII和EcoRI進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3.1膠回收產物；將hNIS基因雙酶切產物和pcDNA3.1膠回收產物與T4?DNA?連接酶和緩沖液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然后挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的質粒pcDNA3.1-hNIS。

在步驟（2）中，PCR擴增全長Fluc基因，凝膠電泳及膠回收PCR產物，將膠回收產物使用NheI和HindIII進行雙酶切，得到Fluc基因雙酶切產物；提取質粒pcDNA3.1-hNIS，使用NheI和HindIII進行雙酶切，然后進行膠回收，得到pcDNA3.1-hNIS膠回收產物；將Fluc基因雙酶切產物和pcDNA3.1-hNIS膠回收產物與T4?DNA?連接酶和緩沖液混合，放在16度水浴鍋過夜連接，第二天轉化大腸桿菌感受態細胞，然后挑單克隆，提質粒，測序，從而得到正確的質粒pcDNA3.1-Fluc-hNIS。