[發明專利]一種在黑曲霉中同源表達木聚糖酶基因xynB的表達載體、基因工程菌株及其應用

無效

• 申請號: 201110333966.3
• 申請日: 2011-10-28
• 公開（公告）號: CN102363788A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 白愛枝;梁運章;李前忠;閆祖威
• 申請（專利權）人: 內蒙古大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N1/15;C12N9/42;C12R1/685
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇;楊小蓉

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地涉及一種在黑曲霉(Aspergillus?niger)中同 源表達木聚糖酶基因xynB的表達載體、高產木聚糖酶的基因工程菌株及其應用。

背景技術

黑曲霉(Aspergillus?niger)木聚糖酶基因xynB的同源表達研究的甚少，2005 年Anthony等利用RT-PCR從Aspergillus?niger?BRFM281mRNA擴增的帶有6個hi?s 標簽的xynB基因克隆到有gpd強啟動子的表達盒，將該表達盒在蛋白酶陰性突變株 Aspergillus?niger?D15#26中進行表達，獲得的一株轉化子中xynB的產量達到 900mg/L；國內的鄭瑞娟將從Aspergullus?nigerTS1中利用同樣方法克隆得到xynB基 因，通過構建與葡萄糖淀粉酶的融合表達質粒，在尿嘧啶缺陷型Aspergullus?nigerM54 中表達，獲得的重組菌的酶活力最高達507IU/mL，分別是原出發菌和宿主菌的6.7 倍和3.89倍。

絲狀真菌黑曲霉(Aspergillus?niger)的同源表達系統在基礎研究和應用研究中 都是極有價值的。在基礎研究中，同源表達系統的建立是從分子水平上研究該菌株 中酶表達調控的先決條件；由于只有同源系統表達的酶才會有與自然酶同樣的結構 特征，因此，同源表達系統又是研究酶的結構功能關系，以定向改造酶的結構，達 到改進酶催化活性和催化特性的重要基礎。在應用研究上，因多拷貝整合是絲狀真 菌轉化的特點，因此，通過轉化引入多拷貝內源基因后，利用菌株中現成的酶形成 機制，可較大幅度地提高酶產量，早年的研究已充分證明了這一點。同源表達較之 異源表達，可有效避免異源表達中難以解決的問題，如分泌過程中蛋白的錯誤折疊 和被內源蛋白酶降解的可能以及物種密碼子的偏好性、基因結構的復雜性等，多種 蛋白酶同源表達的成功表明該策略具有廣泛的應用價值(Verdoes，1995)。

需要解決的技術難題：

1.試驗確定適用于黑曲霉A₃₂₇木聚糖酶基因xynB轉化的載體、選擇標記基因， 構建表達質粒；

2.通過黑曲霉菌株前培養方法，菌絲裂解條件等試驗，建立能獲得足夠數量并 且高質量的原生質球的方法；

3.建立表達分泌載體轉化黑曲霉的轉化技術，提高轉化頻率。

發明內容

本發明的目的是提供一種在黑曲霉中同源表達木聚糖酶基因xynB的表達載體。

本發明的另一目的是提供一種產木聚糖酶的基因工程菌株。

本發明的另一目的是提供一種高產木聚糖酶的基因工程菌株。

本發明的另一目的是提供一種生產木聚糖酶的方法。

本發明的另一目的是提供上述高產木聚糖酶的基因工程菌株在飼料和食品工業 中的應用。

本發明提供的一種在黑曲霉中同源表達木聚糖酶基因xynB的表達載體，其通過 將基因xynB及包括部分啟動子序列在內的非編碼序列插入表達載體pBS-T構建獲 得，其中，所述非編碼序列位于基因xynB的5′端。具體構建方法為：

1)以黑曲霉A₃₂₇的總DNA為模板，設計特異引物，擴增木聚糖酶基因xynB 及包括部分啟動子序列在內的非編碼序列；

2)將基因xynB及包括部分啟動子序列在內的非編碼序列與載體pBS-T連接， 并連入構巢曲霉的終止子和選擇標記基因amds，得到表達質粒pBS-XTP。

其中，所述木聚糖酶基因xynB及包括部分啟動子序列在內的非編碼序列的核苷 酸序列如SEQ?ID?NO.1所示：

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