[發明專利]李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法和PNA探針

無效

• 申請號: 201110333436.9
• 申請日: 2011-10-28
• 公開（公告）號: CN102358909A
• 公開（公告）日: 2012-02-22
• 發明（設計）人: 吳姍;張曉峰;李愛云;李可;帥江冰
• 申請（專利權）人: 浙江省檢驗檢疫科學技術研究院;浙江大學醫學院附屬婦產科醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

1.李斯特菌屬（Listeria?genus）的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，其特征在于：該PNA探針的DNA?序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于該方法包括以下的步驟：

1）離心收集對數生長期的細菌，用50%酒精/磷酸緩沖液固定緩沖液重懸，細菌濃度控制在OD₆₀₀=0.5-1.0,室溫固定1小時后置于-20℃保存；

2）取100μl?固定好的菌體2000g離心5min，棄上清,室溫下加入50μl含300pmole/mlPNA探針的雜交緩沖液，PNA探針的DNA?序列如SEQ?ID?NO：1所示，重懸；

3）樣品于薄壁PCR管中，55℃?水浴1-1.5小時,?加入200μl洗滌緩沖液，洗滌緩沖液預熱至55℃，55℃水浴20min,?2000g離心5min，棄洗滌緩沖液，重復洗滌一次,?取25～30μl洗滌緩沖液重懸，取2～5μl菌液涂片，風干后熒光顯微鏡觀察熒光亮度及細菌的形態。

3.根據權利要求2所述的李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于：磷酸緩沖液包括7mM?Na₂HPO₄、7mM?NaH₂PO₄和130mM?NaCl。

4.根據權利要求2所述的李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于：雜交緩沖液pH9.0，該雜交緩沖液包括20?mM?Tris、100?mM?NaCl和0.5%?SDS。

5.根據權利要求2所述的李斯特菌屬的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于：洗滌緩沖液pH9.0，該洗滌緩沖液包括10?mM?Tris，1?mM?EDTA。