[發明專利]紅豆杉干細胞培養、分離方法

無效

• 申請號: 201110330833.0
• 申請日: 2011-10-27
• 公開（公告）號: CN103087974A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 黃濤
• 申請（專利權）人: 鷺港生物藥業有限公司
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N5/02
• 代理公司: 北京立成智業專利代理事務所(普通合伙) 11310
• 代理人: 張江涵

技術領域

本發明具體涉及一種植物干細胞分離方法，特別涉及一種紅豆杉干細胞培養、分離方法。

背景技術

從藥用植物紅豆杉中提取的藥用成份紫杉醇對于多種癌癥的治療有著重要的應用價值和前景。由于野生紅豆杉是珍稀保護植物，法律禁止砍伐。生產上采用大量種植紅豆杉的辦法為分離提取紫杉醇提供原料。但由于紅豆杉生長周期長，占用耕地；又由于只有紅豆杉樹皮中才含有紫杉醇，且含量極低，大約10噸樹皮中才能提取1公斤紫杉醇，所以這種傳統的生產技術的成本極高。另外，提煉紫杉醇的過程中，由于有外加的化學溶劑，導致提煉后余下不能清除的有毒殘余物，超出指定的劑量而影響治療的功效。

現有技術是通過離體懸浮培養紅豆杉的細胞來生產紫杉醇，這種方法不受紅豆杉生長季節的限制就可以通過規模化生產來獲得紫杉醇。通常取紅豆杉的莖或葉片為外殖體在特定培養基上培養，經過脫分化階段誘導成具有分裂能力的愈傷細胞，進一步將該細胞懸浮培養來生產紫杉醇。

但目前已有的技術在分離紅豆杉細胞時，均采用已經分化的組織器官為外殖體，通過離體培養階段的培養(脫分化過程)將其誘導為具有分化能力的愈傷細胞。但這種細胞的本質是來源于已經分化的體細胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不強。在工業化量產過程中，經常會出現細胞系退化，分裂能力弱，很難進行超大體積的培養。

發明內容

本發明的目的是提供一種紅豆杉干細胞培養、分離方法，用于解決現有技術中的問題，提供一種具有無限分裂能力且分裂能力強的處于未分化狀態的紅豆杉干細胞的培養、分離方法，該干細胞由于本身的性質，在通過離體懸浮培養方法可以進行超大體積的培養，得到大量的干細胞，從而可以大量生產紫杉醇。

本發明解決問題采用的技術方案是：

紅豆杉干細胞培養、分離方法，其特征在于：首先將東北紅豆杉的直徑為1厘米的當年生嫩枝經過0.1％的升汞消毒處理10分鐘，然后從嫩枝上切下包含周皮、韌皮部和形成層在內的外殖體切片，放置在含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定與0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養基上，25℃黑暗下培養；兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉移到轉繼代培養基上培養；繼代培養基為含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定與0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養基上，每兩周繼代一次，短期內可以獲得大量的干細胞。

本發明的有益效果：本發明中培養的干細胞是處于未分化狀態的細胞，具有無限分裂的能力，所以懸浮培養中如果采用干細胞將可以避免脫分化體細胞的缺點，可以得到大量的干細胞，從而可以大量的生產紫杉醇，滿足患者的需要。

附圖說明

圖1是本發明紅豆杉外植體切段圖；

圖2是本發明紅豆杉形成層干細胞誘導增殖圖；

圖3是本發明紅豆杉干細胞繼代增殖圖。

具體實施方式

實施例1：本發明紅豆杉干細胞的培養、分離方法，首先將東北紅豆杉的直徑為1厘米的當年生嫩枝經過0.1％的升汞消毒處理10分鐘，然后從嫩枝上切下包含周皮、韌皮部和形成層在內的外殖體切片(見附圖1)，放置在含有0.5mg.L-1毒莠定與0.5mg.L-1萘乙酸的B5培養基上，25℃黑暗下培養。由于形成層的干細胞分裂速度快，導致形成層干細胞團自然與外殖體其余部分分裂開來(見附圖2)，這種干細胞團質地致密，表面較光滑平整。兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉移到轉繼代培養基上培養(見附圖3)。繼代培養基為含有0.5mg.L-1毒莠定與0.5mg.L-1萘乙酸的B5培養基，每兩周繼代一次，短期內可以獲得大量的干細胞。

實施例2：首先將東北紅豆杉的直徑為1厘米的當年生嫩枝經過0.1％的升汞消毒處理10分鐘，然后從嫩枝上切下包含周皮、韌皮部和形成層在內的外殖體切片，放置在含有0.2mg.L-1毒莠定與1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養基上，25℃黑暗下培養；兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉移到轉繼代培養基上培養；繼代培養基為含有0.2mg.L-1毒莠定與1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養基上，每兩周繼代一次，短期內可以獲得大量的干細胞。