[發明專利]一種可誘導慢病毒miRNA表達載體及其構建方法

無效

• 申請號: 201110329753.3
• 申請日: 2011-10-26
• 公開（公告）號: CN103074375A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 楊操;楊述華;劉映樂;葛挺;劉先哲;李帥;趙伯明
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 武漢楚天專利事務所 42113
• 代理人: 雷速

技術領域

本發明屬于生物技術及醫學領域，具體涉及可誘導慢病毒miRNA表達載體及其構建方法。

技術背景

miRNAs是一種能夠調節基因表達長度為21-25個核苷酸的非編碼RNA鏈，具有控制細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成和藥物敏感性等多種細胞功能。眾所周知，miRNAs經歷過基因擴增、基因刪除和表觀遺傳沉默等基因突變，這些基因突變最終能激活或者滅活疾病基因。在人類多種疾病中，某些miRNAs始終是失調的。這些失調的miRNAs并不局限于特定的疾病類型，而且異常表的miRNAs與臨床病情，如腫瘤分期、藥物敏感性和病人生存率等相關。此外，最近有研究表明miRNAs有助于細胞轉化、腫瘤形成和干細胞維護。最后，miRNAs功能學研究直接觀察到特異性miRNAs在體內或者體外具有強大的抗癌活性或致癌活性。由于異常表達的miRNAs在人類疾病的發展中起著關鍵作用，通過拮抗或者恢復miRNAs的功能來糾正miRNAs的失調和缺陷將會給臨床疾病治療帶來巨大的進步。基于miRNA的治療策略已經成為了一個極具潛力的治療方法。為了使miRNAs成為有效的治療方法，它們應該被系統性調控，通過特異且高效的轉移系統運送到特定組織，然后被靶細胞攝入胞漿。在胞漿中，它們以完整的形式被細胞使用。miRNAs在哺乳動物細胞系用于短期基因抑制是非常有效的，但是用于轉錄水平長期穩定的敲除靶基因是有困難的。與其它核苷酸結構類似，miRNAs在臨床應用上存在穩定性和轉移問題。miRNAs與siRNAs一樣，細胞膜穿透能力差、體內穩定性有限和細胞內轉移依賴于系統調控。為了使miRNAs從一種實驗手段轉變成可使病人受益的臨床治療方法，我們需要一種特異性強且有效的基因轉移表達系統。

由于慢病毒，如人類免疫缺陷病毒I，能轉染分裂細胞或者非分裂細胞并將其DNA整合到宿主細胞基因組中，因而是一種miRNAs治療的有效運載工具。慢病毒載體通常是通過幾種不同的質粒共轉染293T人胚胎腎細胞獲得的。第一個臨床慢病毒載體產物來自雙質粒系統。為了進一步改進該系統的生物安全性，慢病毒基因組被分成了4個質粒。這些質粒分別是：自我失活的轉移質粒、編碼gag-pol蛋白包裝質粒、rev質粒和一個可以編碼水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包膜糖蛋白質粒。慢病毒載體是將目的基因或者基因沉默序列穩定轉移到細胞的最為有效的運載工具?；蜣D移伴有假構型慢病毒包膜蛋白與靶細胞膜結合和融合。然后，含有miRNAs基因或者基因沉默序列的慢病毒基因組RNA被逆轉錄成DNA，并以極高的效率與細胞的基因組永久整合。最后，miRNAs基因或者基因沉默序列在細胞內表達，產生細胞在基因水平上永久性改變的預期效果。

嚴格控制單基因如特異性miRNAs的表達系統將極大的有助于復雜基因環境條件下如哺乳動物細胞miRNAs功能的研究。理想情況下，這樣一個系統不僅可以介導miRNAs表達活性的“開關”狀態，還可以介導在設定閾值水平下允許其有限的表達。

發明內容

本發明的任務是提供一種可誘導慢病毒miRNA表達載體及其構建方法。

實現本發明的技術方案是：本發明提供的這種可誘導慢病毒miRNA表達載體，包含慢病毒轉移結構的基因HIV-1RNA包裝信號、5’LTR和3’LTR以及四環素反應元件(TRE)和EF-1α啟動子，見圖1。本發明方案提供的生產細胞可以是293T腎上皮細胞系、CHO中國倉鼠卵巢細胞、COS非洲猴腎細胞系、HepG2人肝癌細胞系、BHK敘利亞倉鼠腎細胞系、Sf9昆蟲卵巢細胞系、Sf21昆蟲卵巢細胞系、293人胚腎臟細胞、HEK?293人胚腎細胞系、SODk0、NIH-3T3鼠成纖維細胞系、Vero非洲綠猴腎細胞或PerC6人胚腎臟細胞。本發明可誘導表達的基因是miRNA的RNAs。本發明使用的慢病毒基因表達載體是第三代慢病毒基因轉移表達載體，即將整個慢病毒基因組分成四個質粒：自我失活的轉移質粒、編碼gag-pol蛋白包裝質粒、rev質粒和一個可以編碼水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包膜糖蛋白質粒，miRNA的表達具有穩定和可遺傳性，誘導慢病毒miRNA表達載體常用于構建動物模型，如轉基因鼠。

本發明提供的可誘導慢病毒miRNA表達載體構建方法包括以下步驟：

(1)構建pCR2.1-EF-α克隆載體和pCR2.1-TRE克隆載體，具體步驟是：