[發(fā)明專(zhuān)利]一種外周血單核細(xì)胞的富集方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110329478.5
• 申請(qǐng)日: 2011-10-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102352344A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林雋;陳申
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福建省閩東力捷迅藥業(yè)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0786
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0786;A61K35/14;A61P35/00
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種外周血單核細(xì)胞的富集的方法。

背景技術(shù)

大量的實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）治療技術(shù)是一個(gè)非常具有前景的免疫治療手段，尤其在腫瘤治療方面。然而，它的臨床實(shí)際應(yīng)用由于受到了多方面因素影響而一直未能有大的突破，其中原因之一就是缺乏一種有效并易行的手段以提供在質(zhì)量和數(shù)量上都能滿(mǎn)足治療需要的樹(shù)突狀細(xì)胞。

由于外周血中樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)目有限，直接從外周血中富集治療所需的樹(shù)突狀細(xì)胞不太現(xiàn)實(shí)。現(xiàn)有報(bào)道中的樹(shù)突狀細(xì)胞主要來(lái)源于在細(xì)胞因子誘導(dǎo)下外周血單核細(xì)胞（MCs）的體外分化。因此，外周血單核細(xì)胞的富集和純化過(guò)程是樹(shù)突狀細(xì)胞治療實(shí)施的關(guān)鍵之一（現(xiàn)有技術(shù)中MCs一般需要純化到80%以上方可用于臨床，保證治療效果以及安全性）。雖然目前已有的技術(shù)手段如細(xì)胞貼壁吸附，免疫選擇技術(shù)等都能達(dá)到一定的質(zhì)量和數(shù)量上的要求，但它們大都需要配置昂貴的符合GMP條件的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和相對(duì)高的人員素質(zhì)要求，對(duì)臨床應(yīng)用存在著諸多的不便。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種外周血單核細(xì)胞富集方法，該方法可操作性強(qiáng)，耗時(shí)短，得到的產(chǎn)品產(chǎn)量、純度較高，適用于臨床的推廣。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的一種外周血單核細(xì)胞的富集方法，采用血細(xì)胞采集結(jié)合離心淘洗。

其中血細(xì)胞采集采用的抗凝劑與全血的比率為1：5?-1：20。

抗凝劑與全血的比率為1：12-1：13。

血細(xì)胞采集過(guò)程所處理血量為自身血容量的2-4倍。

血細(xì)胞采集過(guò)程中給予患者靜脈鈣劑的輸注。

????如所述的富集方法得到的外周血單核細(xì)胞在腫瘤治療中的應(yīng)用。

血細(xì)胞采集分離結(jié)合離心淘洗技術(shù)（Centrifugal??Elutriation）的原理是基于細(xì)胞的物理性質(zhì)而通過(guò)離心分離的，相比于抗原-抗體結(jié)合為原理的免疫選擇技術(shù)而言所得到的細(xì)胞產(chǎn)物可能更加“純樸”。我們的富集結(jié)果也表明，該方法得到的產(chǎn)品純度較高，此外還具有臨床適用性高、產(chǎn)量大的特點(diǎn)。

相對(duì)于較為成熟和一致的由MCs到DCs的體外誘導(dǎo)分化方法而言，用于DCs治療為目的的MCs的富集及純化在業(yè)內(nèi)尚無(wú)較為統(tǒng)一的方法。我們的應(yīng)用結(jié)果表明，基于離心淘洗技術(shù)為基礎(chǔ)的MCs富集及純化方法是較為非常理想的方法，具體表現(xiàn)如下。1）臨床適用性：自動(dòng)化設(shè)備的應(yīng)用省去了許多對(duì)臨床單位來(lái)說(shuō)相對(duì)苛刻的要求，由于所有的采集及分離過(guò)程均在密閉體系中進(jìn)行，無(wú)需附加的符合GMP條例的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施。其次，時(shí)效性極高，MNC采集結(jié)束后的一個(gè)小時(shí)左右即可得到純度高的MCs終產(chǎn)物。2）可靠的產(chǎn)品質(zhì)量：由于細(xì)胞淘洗技術(shù)的原理是基于細(xì)胞的物理性質(zhì)而通過(guò)離心分離的，相比于抗原-抗體結(jié)合為原理的免疫選擇技術(shù)而言所得到的細(xì)胞產(chǎn)物可能更加“純樸”。?3）充足的產(chǎn)量：由于現(xiàn)代DCs治療需要足夠量的細(xì)胞以滿(mǎn)足多次、系列注射的需要。

具體實(shí)施方式

1????????對(duì)象??計(jì)劃接受DCs治療的癌癥患者共17位，其中卵巢癌患者9例，乳腺癌患者和黑色素瘤患者各4例。

2????????方法及原理??首先采用血細(xì)胞分離機(jī)采集外周血單個(gè)核細(xì)胞（MNC），然后利用自動(dòng)化細(xì)胞淘洗設(shè)備將初步收集產(chǎn)物根據(jù)細(xì)胞大小及密度的不同分離成不同的細(xì)胞成分。所有患者進(jìn)行MNC采集前都經(jīng)歷過(guò)化療或放療，MNC采集時(shí)間與最后一個(gè)化療或放療的療程間的間隔為至少2-3周。

3????????2.1?MNC采集???所有患者應(yīng)用COBE?SPECTRA?血細(xì)胞分離機(jī)的AUTO?PBSC?程序（美國(guó)CARIDIAN?BCT公司）進(jìn)行大處理量的MNC?采集。大處理量的定義為處理血量至少為自身血容量的兩倍，使用的抗凝劑ACD-A與全血的比率為1：12?到1：13。采集過(guò)程中，所有患者給予靜脈鈣劑的輸注以避免枸櫞酸相關(guān)的副反應(yīng)的發(fā)生。

2.2?細(xì)胞淘洗???MNC初級(jí)產(chǎn)物經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后將相關(guān)數(shù)據(jù)（包括白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、總體積）輸入?Elutra?Cell?Separation?System?細(xì)胞淘洗機(jī)（美國(guó)CARIDIAN?BCT公司產(chǎn)品）中。根據(jù)設(shè)備提示接通一次性使用的密閉管道，設(shè)備將自動(dòng)運(yùn)行并生成五個(gè)不同的成分同時(shí)分裝于五個(gè)不同的密閉塑料袋中。

2.3?細(xì)胞計(jì)數(shù)???收集患者M(jìn)NC采集前、后外周血，MNC初級(jí)產(chǎn)物及五個(gè)不同成分的樣本分別予以細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3??數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)???所有數(shù)據(jù)以mean±s表示，外周血單核細(xì)胞的回收率計(jì)算=終產(chǎn)品中外周血單核細(xì)胞絕對(duì)數(shù)×100%÷MNC初產(chǎn)品中外周血單核細(xì)胞絕對(duì)數(shù).