[發明專利]球形棕囊藻培養液的除菌方法

有效

• 申請號: 201110329306.8
• 申請日: 2011-10-26
• 公開（公告）號: CN102391954A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 鄭天凌;黃麗萍;蘇建強;鄭小偉;周艷艷
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12R1/89
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及一種微藻培養液，尤其是涉及一種球形棕囊藻培養液的除菌方法。

背景技術

在赤潮的微生物防治研究領域中，藻液中細菌的存在對不可培養的溶藻微生物的純化，以及溶藻微生物和殺藻物質的殺藻機制的研究帶來了極大困難，因此希望能夠通過對藻液進行除菌處理來排除藻際環境細菌的干擾。

目前報道的藻液除菌方法主要有：①顯微鏡下挑取單個藻細胞，用無菌的藻培養基進行反復洗滌，然后接種于藻培養基中，該法操作較為麻煩，需要一定的藻類分離經驗，同時單個藻細胞的培養難度較大；②利用化學物質殺滅細菌，包括十二烷基磺酸鈉(SDS)等去垢劑，但化學物質同時也會對藻造成傷害；③利用抗生素特異性的殺死細菌，這是最為簡便且廣泛使用的方法，其缺點是不同抗生素其作用的細菌不同，有些抗生素并不能完全殺死細菌，有些抗生素同時也會對藻造成傷害。

為了測定SDS和抗生素對藻的抑制作用，需要一種快速而準確的藻細胞密度測定方法。目前藻細胞計數的方法主要有(1.胡先文，董元彥，張新萍，葉發兵，可見分光光度法測定水華魚腥藻.華中農業大學學報，2002(03)：295-297；2.侯建軍，黃邦欽，戴相輝，赤潮藻細胞計數方法比較研究.中國公共衛生，2004(08)；3.董正臻，董振芳，丁德文，快速測定藻類生物量的方法探討.海洋科學，2004(11)：1-2，5；4.Imai，I.，Y.Ishida，K.Sakaguchi，Y.Hata，Algicidal?marine?bacteria?isolated?from?northern?Hiroshima?Bay，Japan.Fisheries?science.Tokyo，1995.61(4)：628-636)：光學顯微鏡直接計數法、可見光分光光度法、熒光分光光度法、葉綠素a測定法、流式細胞計數法、庫爾特計數法和活體熒光檢測技術等。顯微計數法工作量大，人為誤差也較大；葉綠素a含量測定法耗費時間長；流式細胞計數法樣品需經過一定的前處理，摸索出適合的儀器參數，同時流式細胞儀價格也較昂貴；庫爾特計數線性范圍較小，適用于藻密度較小時；活體熒光檢測技術一次只能對一個樣品進行測定，多樣品時更換樣品的操作同樣繁瑣。

利用酶標儀進行測定的熒光光度法和分光光度法一次可以測定96個樣品，滿足快速測定的要求。SDS裂解細胞后產生的白色沉淀對吸光值的影響較大，對熒光值影響較小，且用熒光光度法測定的SDS處理藻液的藻細胞密度結果與肉眼觀察結果一致；抗生素處理藻液后不產生白色沉淀，不會干擾吸光值，且用分光光度法測定的抗生素處理藻液的藻細胞密度結果與肉眼觀察結果一致；因此本發明分別選用熒光光度法和分光光度法測定SDS和抗生素處理藻液的藻細胞密度。

此外，在各種除菌方法中，最重要的一步是如何以有效、準確、可靠的手段來證實所獲得的體系內是否真的無菌。報道的許多方法只是利用各種培養基進行細菌培養實驗，一旦發現沒有細菌生長，就認為是無菌的，考慮到大多數的微生物都是未可培養的，這個檢驗結果并不可信；另外還有報道分別利用表面熒光顯微鏡觀察以及對真細菌和古細菌16S?rDNA進行特異性擴增來檢驗細菌是否存在(5.Su，J.Q.，X.R.Yang，T.L.Zheng，H.S.Hong，An?efficient?method?to?obtain?axenic?cultures?of?Alexandrium?tamarense--a?PSP-producing?dinoflagellate.Journal?of?Microbiological?Methods，2007.69(3)：425-430.)。在前期實驗中，我們發現真細菌16S?rDNA保守性引物可以擴增出球形棕囊藻的線粒體DNA片段，因此不能用該方法來檢測藻液中是否有菌存在。于是本發明同時利用微生物培養和表面熒光顯微鏡觀察的方法來檢測經除菌處理的藻液及其傳代藻液中是否有菌存在，兩種檢測方法一起使用使檢驗結果更準確、可靠。

發明內容

本發明的目的是提供一種球形棕囊藻培養液的除菌方法。

本發明的具體步驟是：

1)取生長至對數期的藻液，離心，去上清；

2)用f/2培養基重懸藻細胞，離心，去上清，重復此步驟2次，然后用f/2培養基重懸藻細胞；

3)加入SDS和8種抗生素，所述8種抗生素為克林霉素、阿奇霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、頭孢霉素、氨芐青霉素和利福霉素；