[發明專利]可直接觀察HBVcccDNA在肝組織中分布定位的試劑盒

有效

• 申請號: 201110328026.5
• 申請日: 2011-10-25
• 公開（公告）號: CN102534047B
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 鐘彥偉
• 申請（專利權）人: 鐘彥偉
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢

1.一種可直接觀察HBVcccDNA在肝組織中的分布及定位的檢測試劑盒，檢測對象是肝組織切片；所述試劑盒含有去污劑、dNTP和1×PBS、組織切片固定劑、脫蠟試劑、封閉試劑、無水乙醇、蛋白酶、PSAD酶、Phi29 DNA聚合酶、滾環引物、Phi29 buffer、1×TBS、NBT/BCIP和堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體；其特征是：

(1)還含有如下引物序列：

P59： 5-GGCCACCTCTCTTTA-3

P83： 5-DIGCGGCACAGCTTGGAGG-3；

(2)還含有核固紅；

(3)所述封閉試劑是BSA；

(4)所述滾環引物有8個，序列為如下所示：

(5)還含有鹽酸；

所述組織切片固定劑的組成是：85％無水乙醇、10％甲醛和5％冰醋酸；

所述蛋白酶是蛋白酶K，所述脫蠟試劑是二甲苯，所述去污劑是TritonX-100；

所述鹽酸的濃度是0.2mmol/L，所述TritonX-100的濃度是0.1％，所述BSA的濃度是3％，所述核固紅的濃度是0.1％；

檢測方法步驟為：將患者肝組織樣本固定，消化，然后進行PCR擴增，最后檢測擴增產物；

1)所述樣本固定是將肝組織樣本經10％甲醛固定，石蠟包埋，連續切片；

2)所述消化是用蛋白酶和PSAD酶進行消化；

3)所述PCR擴增是在肝組織切片上進行原位滾環加跨缺口PCR擴增；

4)擴增產物的檢測是在滾環加跨缺口PCR擴增后的肝組織切片上滴加堿磷酶標記的抗地高辛抗體，孵育一定時間后，滴加NBT/BCIP；室溫普通顯微鏡下肉眼直接觀察肝組織切片顯色情況，細胞核出現藍色、紫色及紫藍色顆粒者為HBVcccDNA表達陽性，細胞核出現紅色者為HBVcccDNA表達陰性；

5)整個檢測過程均在載有肝組織切片的玻璃載玻片上進行。

2.權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述肝組織樣本固定的方法是：將肝組織樣本經10％甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，二甲苯脫蠟后，梯度乙醇脫水，室溫干燥。

3.權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述消化是先采用蛋白酶消化肝組織切片增加組織通透性，然后采用PSAD酶消化肝組織中非共價閉合環狀DNA。

4.權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：進行原位滾環加跨缺口PCR擴增所用儀器為原位PCR儀。

5.權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：進行原位滾環加跨缺口PCR擴增是在組織切片上加入滾環擴增引物和跨缺口引物，進行滾環加跨缺口原位PCR擴增HBVcccDNA。

6.權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述擴增產物的檢測是在組織切片上滴加堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體，37℃孵育，1×TBS洗滌；滴加NBT/BCIP，暗處室溫顯色；0.1％核固紅復染胞核，室溫干燥后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并記錄結果。