[發明專利]腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法

無效

• 申請號: 201110327991.0
• 申請日: 2011-10-25
• 公開（公告）號: CN102441011A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 姜國勝;李鵬;宋楠楠;岳盈盈;李志會;孟紅
• 申請（專利權）人: 山東省醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: A61K35/76
• 分類號: A61K35/76;A01K67/027
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術領域

本發明涉及一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法。

背景技術

腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，是手足口病(HFMD)的主要病原(Hand?Foot?and?Mouth?Disease，HFMD)。自2008年以來我國多次發生EV71的暴發感染，時有病死發生，已經成為備受關注的公共衛生問題。目前其感染和致病機制、病毒結構特征及毒力相關基因等還不明確，并且臨床缺乏有效的藥物和疫苗。因此深刻理解病毒生物學特性與宿主感染的相互關系，疫苗設計研發及藥物篩選研究意義重大。

由于EV71病毒具有嚴格的宿主特異性，目前國內尚未建立穩定的動物感染模型。這一現狀從根本上制約了EV71臨床基礎研究和臨床防治策略的制定，導致臨床高效特異的治療藥物和預防性疫苗的缺乏。因此，建立穩定的動物感染模型成為EV71研究和防治的關鍵問題。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，動物模型的建立可促進對腸道病毒71型致病機制和宿主免疫機制的研究，并可用于高效抗病毒藥物的篩選和疫苗評價，為EV71病原學研究、臨床治療研究以及疫苗學研究解決了關鍵性難題。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種腸道病毒71型感染7日齡C57/BL6小鼠模型的建立方法，包括以下步驟：取7日齡C57/BL6小鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得腸道病毒71型感染的小鼠模型。

所述病毒液注射量為20μL，是通過以下方法制得的：將EV71毒種，以200μL/100mL細胞培養瓶的接種量接種MA104細胞，37℃、5％CO₂培養，每天觀察細胞病變情況，至MA104細胞70％出現凝集、皺縮時，將整瓶細胞凍融，離心取上清，即得到EV71的病毒液。

所述EV71毒種，為現有技術中已有的，常規取得即可，本發明對此無限制，不再贅述。

所述建立方法，還包括以下小鼠模型的鑒定步驟：飼養上述接種腸道病毒71型的小鼠，5天后，后肢出現反應遲緩、后肢癱瘓，7天后死亡的，即為感染成功的小鼠模型。

本發明成功地建立了穩定的腸道病毒71型感染的小鼠模型，其后肢癱瘓率一般為70％～100％，死亡率為30～100％。本發明為科研人員研究腸道病毒71型病原學、腸道病毒71型致病機制以及高效抗病毒藥物的篩選和疫苗的研制提供了基礎，具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1為臨床分離毒株的RT-PCR鑒定的電泳圖，其中，M＝Maker(D2000)，N＝陰性細胞對照，B＝空白試劑對照，1＝分離毒株。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明。

實施例1建立感染腸道病毒71型的7日齡C57/BL6小鼠模型

步驟如下：

1、EV71的分離鑒定

本發明所采用的EV71毒株是從臨床的重癥手足口病人的糞便標本中分離的，同時采用人橫紋肌肉瘤細胞株(RD)、恒河猴腎細胞株(MA104)和非洲綠猴腎細胞株(Vero)三種細胞對標本中的病毒進行分離，結果三種細胞上菌出現了細胞病變，傳代后凍存毒種。然后提取分離到的EV71的基因組RNA，逆轉錄成cDNA，采用EV71國家標準引物對分離毒株進行鑒定，結果表明分離毒株在226bp處出現了很亮的條帶(如圖1所示)，可證實從臨床手足口重癥病人糞便標本中分離的毒株為EV71。

2、EV71感染動物模型的建立

2.1小鼠的準備

購買SPF級別的C57/BL6乳鼠2組(帶母鼠)，每組6只，25℃、濕度50％，分格飼養在ABSL-2實驗室的凈化動物飼養柜內，每天觀察動物生長情況，C57/BL6乳鼠生長狀態良好。

2.2毒種的準備

將分離的EV71毒種，以200μL/100mL細胞培養瓶的接種量接種MA104細胞，37℃、5％CO₂培養，每天觀察細胞病變情況。接種EV71后第2天，MA104細胞約70％出現了凝集、皺縮，將整瓶細胞凍融后，離心取上清，即得到EV71的病毒液。

2.3EV71感染動物模型的建立

2.3.1動物分組

將兩組動物分別設為病毒組和正常對照組，病毒組肌注接種EV71病毒，正常對照組左后肢肌注接種含2％胎牛血清的1640培養液。

2.3.2接種EV71