[發(fā)明專利]一種在異養(yǎng)微生物體內(nèi)直接合成脂肪醇的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110327887.1
• 申請日: 2011-10-26
• 公開（公告）號: CN102337303A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉天罡;劉然;朱發(fā)銀
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號: C12P7/02
• 分類號: C12P7/02;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12R1/19;C12R1/865
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 薛玲

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于可再生能源和生物質(zhì)能源以及化工原料生產(chǎn)領(lǐng)域，具體涉及改造異養(yǎng)微生物自身脂肪酸代謝途徑從而生產(chǎn)脂肪醇的方法。

背景技術(shù)

脂肪醇(fatty??alcohol)是洗滌劑用表面活性劑的原料之一，在洗滌劑、護(hù)膚品、化妝品、藥品中有大量運用。脂肪醇最早是由鯨蠟制取的，所得的混合脂肪醇經(jīng)磺化中和后成為硫酸鹽，是最早的一種陰離子洗滌劑。其后開發(fā)利用來源比較豐富的椰子油、棕櫚油和牛油為原料，水解所得脂肪酸再還原為醇，統(tǒng)稱為天然脂肪醇。石油化學(xué)工業(yè)發(fā)展后，以石油產(chǎn)品為原料，生產(chǎn)的脂肪醇稱為合成脂肪醇。但是依靠石油產(chǎn)品為原料的脂肪醇也得依靠石油的儲備量，在資源日益稀缺的今天，這種發(fā)展方式將會逐漸淘汰，因此，需要一種更加環(huán)保，可再生的生產(chǎn)方式。如果能夠通過在改造后的脂肪酸代謝通路中異源表達(dá)脂肪醇合成酶，即脂肪酰輔酶A還原酶，即可以通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生大量的脂肪醇。

Michael等人在2000年純化了jojoba的fatty?acyl?CoA?reductase,并證明該基因——jojoba?far能將脂肪酸還原成為脂肪醇，該工作發(fā)表在“Plant?Physiology”（James?G.?Metz,?Michael?R.?Pollard?1?,?Lana?Anderson,?Thomas?R.?Hayes,?and?Michael?W.?Lassner.?2000.Purification?of?a?Jojoba?Embryo?Fatty?Acyl-Coenzyme?A?Reductase?and?Expression?of?Its?cDNA?in?High?Erucic?Acid?Rapeseed.?Vol.?122:?635–644）。Tan等在缺乏合成脂肪醇能力的藍(lán)細(xì)菌Syn-LY2菌株中分別表達(dá)了來自于jojoba,鼠，擬南芥等的脂肪酰輔酶A還原酶FAR，發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)jojoba及其中一種擬南芥FAR的藍(lán)細(xì)菌能夠合成脂肪醇，而異源表達(dá)其他的幾種FAR的藍(lán)細(xì)菌不能產(chǎn)生脂肪醇。該工作發(fā)表在“Metabolic?Engineering”上（Tan?X?,?Yao?L,?Lu?X.?et?al.2010.Photosynthesis?driven?conversion?of?carbon?dioxide?to?fatty?alcohols?and?hydrocarbons?in?cyanobacteria.?Metabolic?Engineering?13?(2011)?169–176）。劉天罡教授等人開發(fā)了一個“cell?free”體系，將脂肪酸代謝途徑中的限速步驟進(jìn)行了研究，指導(dǎo)如何提高微生物體內(nèi)的脂肪酸含量，該工作發(fā)表于?“Metabolic?Engineering”(Tiangang?Liu?,?Harmit?Vora?,?Chaitan?Khosla.2010.Quantitative?analysis?and?engineering?of?fatty?acid?biosynthesis?in?E.?coli.?Metabolic?Engineering?12?:378–386)。脂酰輔酶A還原酶基因便于進(jìn)行優(yōu)化，目前可以進(jìn)行遺傳操縱的微生物種類繁多，脂肪酸合成代謝途徑又是每種微生物生存的必需條件，并且目前的研究已經(jīng)對該條途徑認(rèn)識較為深刻，其限速步驟基本清楚，利于進(jìn)行改造。目前僅有學(xué)者在能夠進(jìn)行光合自養(yǎng)的藍(lán)細(xì)菌中利用了jojoba?far基因生產(chǎn)脂肪醇，眾所周知，由于異養(yǎng)微生物生長迅速并且需要外源補充營養(yǎng)物質(zhì)，這就便于通過補充培養(yǎng)基或者增加某些營養(yǎng)成分來提高其生產(chǎn)能力，使其在工業(yè)上實現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。并且由于其必須依賴人工補給養(yǎng)料，所以可以嚴(yán)格控制其生產(chǎn)的各個階段，防止其肆意生長而造成無法控制的局面。目前工業(yè)上已經(jīng)有許多利用異養(yǎng)微生物生產(chǎn)發(fā)酵獲得產(chǎn)品的成功實例，利用脂酰輔酶A還原酶基因在異養(yǎng)微生物體內(nèi)通過改造其自身代謝途徑生產(chǎn)脂肪醇有很大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用異養(yǎng)微生物進(jìn)行生物合成脂肪醇的方法，在異養(yǎng)微生物體內(nèi)改造其脂肪酸代謝途徑以及表達(dá)外源蛋白以生產(chǎn)重要的化工原料——脂肪醇。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的在異養(yǎng)微生物體內(nèi)合成脂肪醇的方法，其是將脂肪酰輔酶A還原酶基因?qū)氘愷B(yǎng)微生物體內(nèi)，并將該基因克隆于表達(dá)載體上，導(dǎo)入相應(yīng)的異養(yǎng)微生物體內(nèi)，并誘導(dǎo)表達(dá)。