[發(fā)明專利]一種重組人源膠原蛋白及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110327865.5
• 申請(qǐng)日: 2011-10-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102443057A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-05-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊樹(shù)林;劉斌;高立虎;李冰;雷云霆;張靜;胡利;唐啟偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/78
• 分類號(hào): C07K14/78;C12N15/12;C12N15/81;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 南京理工大學(xué)專利中心 32203
• 代理人: 唐代盛

1.一種重組人源膠原蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ?NO.3，其含有599個(gè)氨基酸，分子量為55.0kDa。

2.一種重組人源膠原蛋白的制備方法，其特?征在于步驟如下：

（1）表達(dá)重組人源膠原蛋白基因工程菌的構(gòu)建，得到巴氏畢赤酵母基因工程菌；

（2）對(duì)基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)重組人源膠原蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，得到含有重組人源膠原蛋白的發(fā)酵液；

（3）從發(fā)酵液中純化重組人源膠原蛋白。

3.????根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人源膠原蛋白的制備方法，其特征在于所述表達(dá)重組人源膠原蛋白基因工程菌的構(gòu)建如下：

????1)?基于人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈膠原域Gly-X-Y的三肽重復(fù)序列特征，設(shè)計(jì)并人工合成一段人源膠原蛋白基因單體，其核苷酸序列如SEQ?NO.1；然后通過(guò)體外酶切連接，利用大腸桿菌作為克隆宿主，構(gòu)建含有同向六串聯(lián)人源膠原蛋白基因單體的表達(dá)載體，該同向六串聯(lián)人源膠原蛋白基因單體的核苷酸序列如SEQ?NO.2；

2)?將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入巴氏畢赤酵母進(jìn)行重組人源膠原蛋白的表達(dá)，得到的巴氏畢赤酵母基因工程菌已在保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為：CGMCC?NO.?5021。

4.????根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人源膠原蛋白的制備方法，其特征在于基因工程菌的培養(yǎng)基為：

1)?種子培養(yǎng)基：100mM磷酸緩沖液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油(V/V)；

?2)?分批發(fā)酵培養(yǎng)基：85%?H₃PO₄??26.7ml/L；CaSO₄??0.93g/L；K₂SO₄??18.2g/L；MgSO₄·7H₂O??14.9g/L；KOH??4.13g/L；甘油??40.0g/L，滅菌后再加入PTM₁微量元素；其中PTM₁微量元素：CuSO₄·5H₂O??6.0g/L；NaI??0.08g/L；MnSO₄·H₂O??3.0g/L；NaMoO₄·2H₂O??0.2g/L；H₃BO₃??0.02g/L；CoCl₂??0.5g/L；ZnCl₂??20.0g/L；FeSO₄·7H₂O??65.0g/L；生物素??0.2g/L；H₂SO₄??5.0ml/L，用0.22μm的濾膜過(guò)濾除菌，室溫保存；

3)?補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基：50%(W/V)甘油，每升含12mL的PTM₁微量元素；

4)?發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基：100%甲醇，每升含12mL的PTM₁微量元素。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人源膠原蛋白的制備方法，其特征在于基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件及重組人源膠原蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件為：

采用分批-補(bǔ)料培養(yǎng)方法，培養(yǎng)溫度28℃，pH5.0，即1）將種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種按10%接種量加入含分批發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵罐中開(kāi)始培養(yǎng)，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為500?r/min?-800?r/min?、罐壓為0.2-1.0bar、空氣流量為200?In/h?-300?In/h，使溶氧>30%；2）當(dāng)碳源耗盡后，溶氧陡然上升，開(kāi)始流加補(bǔ)料生長(zhǎng)培養(yǎng)基，流加速率為維持溶氧>20%，至菌體濕重達(dá)180~220g/L，停止補(bǔ)加甘油；3）甘油耗盡后補(bǔ)入發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量和流加甲醇速度使溶氧>20%，誘導(dǎo)發(fā)酵96-120h后，結(jié)束發(fā)酵，收集發(fā)酵液。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人源膠原蛋白的制備方法，其特征在于重組人源膠原蛋白的提取純化如下：對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，收集上清液，上清液經(jīng)濾膜過(guò)濾后，用Sephadex?G100凝膠柱層析分離純化，再經(jīng)冷凍干燥得到成品。