[發明專利]一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法

有效

• 申請號: 201110326882.7
• 申請日: 2011-10-25
• 公開（公告）號: CN102393342A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 馬宏偉;朱志強;汪杰
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所
• 主分類號: G01N5/00
• 分類號: G01N5/00;G01N5/02
• 代理公司: 西安創知專利事務所 61213
• 代理人: 譚文琰

1.一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一、對表面修飾有自組裝層的QCM芯片表面進行羧基功能化；

步驟二、將碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺按照1∶1的摩爾比溶解于去離子水中，得到溶質濃度為0.1M的活化液，將步驟一中經羧基功能化后的QCM芯片表面用所述活化液孵育0.5h～2h，然后用去離子水沖洗，再用氮氣吹干；

步驟三、將步驟二中吹干后的QCM芯片表面用氨基功能化的端粒酶引物溶液孵育1h～2h，用去離子水沖洗后用氮氣吹干，得到固定有引物的QCM芯片；所述氨基功能化的端粒酶引物溶液中氨基功能化的端粒酶引物的濃度為1μM～2μM；

步驟四、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液，待基線穩定后，讀取石英晶體微天平監測到的頻率F1，然后通過六通閥向反應器中加入對照液，待對照液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使對照液駐留在反應器中，反應0.5h～2h后，打開蠕動泵，通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監測到的頻率F2，計算頻率F1和頻率F2的差值ΔF；所述工作液為Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的濃度為30mM～70mM，KCl的濃度為30mM～70mM，MgCl₂的濃度為0.5mM～1.5mM；

步驟五、將步驟三中固定有引物的QCM芯片裝入石英晶體微天平的反應器中，采用六通閥和蠕動泵作為進樣裝置，向反應器中通入工作液，待基線穩定后，讀取石英晶體微天平監測到的頻率F1′，然后通過六通閥向反應器中加入含待測試劑的待測液，待待測液全部進入反應器中，關閉蠕動泵，使待測液駐留在反應器中，反應0.5h～2h后，打開蠕動泵，通入工作液沖洗QCM芯片，讀取石英晶體微天平監測到的頻率F2′，計算頻率F1′和頻率F2′的差值ΔF′，計算ΔF′與步驟四中ΔF的比值，當ΔF′/ΔF≤50％時，判定待測試劑為端粒酶抑制劑；所述工作液為Tris·HCl、KCl和MgCl₂的混合水溶液，工作液中Tris·HCl的濃度為30mM～70mM，KCl的濃度為30mM～70mM，MgCl₂的濃度為0.5mM～1.5mM。

2.根據權利要求1所述的一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟一中所述表面修飾有自組裝層的QCM芯片的制備方法為：將金基底的QCM芯片浸泡到總濃度為1mM～10mM的溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的混合溶液中，其中溴代異丁基十一硫醇與三羥基乙基十一硫醇的比例為1∶10～100，室溫下孵育15小時，然后將QCM芯片取出，用乙醇沖洗干凈，再用氮氣吹干，得到表面修飾有自組裝層的QCM芯片。

3.根據權利要求1所述的一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟一中所述QCM芯片表面羧基功能化的方法為：配置去離子水與甲醇體積比為1∶1的混合溶液，向每升混合溶液中加入16mmol?2，2′-聯吡啶，5mmol寡聚甲基丙烯酸寡乙二醇酯，5mmol甲基丙烯酸-2-羥基乙酯混合，并加入0.004mmol的氯化銅，得到淡藍色的溶液，對淡藍色溶液除氧10min～30min，隨后向每升除氧后的淡藍色溶液中加入0.004mmol抗壞血酸，保持氮氣氛圍，得到紅色溶液，將QCM芯片置于紅色溶液中，并將整個反應體系移至手套箱中，室溫下反應4h～16h，將QCM芯片從反應液中取出，用甲醇和去離子水交替沖洗QCM芯片，然后用氮氣吹干，最后將QCM芯片置于含10mg·mL^-1琥珀酐及15mg·mL^-14-二甲氨基吡啶的二甲基甲酰胺溶液中反應12小時，得到表面羧基功能化的QCM芯片。

4.根據權利要求1所述的一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟三中所述氨基功能化的端粒酶引物為5′端氨基功能化的端粒酶引物，所述端粒酶引物的序列為：5′-TTT?TTT?TTT?TAATCC?GTC?GAG?CAG?AGT?T-3′。

5.根據權利要求1所述的一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟四中所述對照液由10μL含端粒酶的HeLa細胞提取物，80μL工作液，10μL水和2μL濃度為100μM的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成。

6.根據權利要求1所述的一種利用石英晶體微天平篩選端粒酶抑制劑的方法，其特征在于，步驟五中所述待測液由10μL濃度為1ng·mL^-1的待測試劑，10μL含端粒酶的HeLa細胞提取物，80μL工作液和2μL濃度為100μM的三磷酸脫氧核糖核苷混合而成。