[發(fā)明專利]一個(gè)與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110326770.1
• 申請(qǐng)日: 2011-10-25
• 公開（公告）號(hào): CN102505013A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊劍波;陸徐忠;倪金龍;馬卉;倪大虎;李莉;馬琳;張小娟;宋豐順;汪秀峰;楊亞春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責(zé)任公司 34101
• 代理人: 何梅生;王偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于水稻分子標(biāo)記輔助選育和種子純度鑒定的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是利用一種水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標(biāo)記對(duì)水稻溫敏核不育系進(jìn)行輔助選育及溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定。

背景技術(shù)

水稻光、溫敏不育資源(即兩系不育資源)的發(fā)現(xiàn)及其在雜交水稻上的成功應(yīng)用，為保障我國(guó)糧食安全問(wèn)題發(fā)揮了重要作用。與三系不育系相比，兩系不育系具有自我繁殖、恢復(fù)譜廣等優(yōu)點(diǎn)，因此，近年兩系法雜交水稻在我國(guó)發(fā)展較快，種植面積和推廣范圍迅速擴(kuò)大。據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，2009年全國(guó)種植面積超過(guò)400萬(wàn)畝的雜交水稻品種全部為兩系水稻。

兩系不育系的快速選育，是推動(dòng)兩系雜交水稻迅速發(fā)展的重要前提。傳統(tǒng)的光溫敏不育系的選育往往是以不育材料為母本，與可育材料雜交或回交，將F2代或回交后代正季種植，在長(zhǎng)日高溫條件下選擇不育單株，然后割蔸帶至海南進(jìn)行冬春季隔離繁殖；繁殖收獲的種子帶回內(nèi)地種植，正季進(jìn)行不育性狀鑒定，再割蔸帶至海南冬春季隔離繁殖。正季不育性狀鑒定和海南島繁殖交替進(jìn)行數(shù)次，以選育穩(wěn)定的兩系不育系。若在選育過(guò)程中，正季出現(xiàn)連續(xù)低溫多雨天氣，無(wú)法進(jìn)行不育性狀鑒定，必須待到下一年正季重新鑒定，大大延緩了兩系不育系的選育進(jìn)度。

分子標(biāo)記輔助育種是指利用與特定性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記作為輔助手段進(jìn)行的育種。開發(fā)與水稻光、溫敏不育性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，并應(yīng)用于兩系不育系的輔助選育，將大大提高不育系的選育效率。InDel(insertion-deletion)標(biāo)記即插入缺失標(biāo)記，指的是兩種基因型在全基因組中的差異，相對(duì)于另一個(gè)基因型而言，其中一個(gè)基因型的基因組中有一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失。根據(jù)基因組中插入缺失位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一些特異擴(kuò)增識(shí)別這些插入缺失位點(diǎn)的PCR引物，這就是InDel標(biāo)記，是一類共顯性標(biāo)記。

目前我國(guó)生產(chǎn)應(yīng)用的大多數(shù)溫敏核不育系的不育基因來(lái)源于安農(nóng)S或其同型系及衍生系，表現(xiàn)為高溫不育、低溫可育，其育性主要由溫敏核不育基因tms5(Thermo-sensitive?Genic?Male?Sterile?Gene)控制。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，溫敏核兩系不育系(如安農(nóng)S-1)和其恢復(fù)系(如93-11)等在tms5區(qū)域存在序列差異。依據(jù)此段序列差異開發(fā)了一個(gè)InDel標(biāo)記，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明：該標(biāo)記能夠通過(guò)特異識(shí)別tms5位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)溫敏核不育基因的鑒定，一方面能夠用于溫敏核兩系不育系的輔助選育，另一方面也可以用于溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)溫敏核不育系與恢復(fù)系(或具恢復(fù)能力的雜交親本)在tms5區(qū)域的序列差異，開發(fā)了一個(gè)與tms5緊密連鎖的InDel標(biāo)記SJ001，利用PCR技術(shù)對(duì)該標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段數(shù)量和大小，判斷被檢水稻樣品是否為溫敏型不育材料，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)溫敏核不育系的輔助選育及溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定。

本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題采用如下方案：

一種與水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標(biāo)記SJ001，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，或含有SEQ?ID?NO：1所示核苷酸序列。

本發(fā)明水稻溫敏不育基因tms5緊密連鎖的InDel標(biāo)記的應(yīng)用方法為，設(shè)計(jì)如下引物對(duì)水稻樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增差異，實(shí)現(xiàn)水稻溫敏核不育系的輔助選育及溫敏型兩系水稻純度的快速鑒定，

SJ001-F：5’ATATTTGGCGCTCTATTCTT?3’

SJ001-R：5’GGCCAAGTGTTATGATCACT?3’。

所述擴(kuò)增差異，指產(chǎn)物電泳譜帶類型：攜有tms5基因的溫敏核不育系會(huì)擴(kuò)增出一條387bp的譜帶；攜有tms5基因的溫敏型兩系雜交水稻會(huì)擴(kuò)增出大小分別為463bp和387bp的兩條譜帶；不攜有tms5基因的水稻會(huì)擴(kuò)增出一條463bp的譜帶。

本發(fā)明水稻樣品包括但不限于水稻的種子、幼苗、葉片、根、莖、穗；所述的水稻溫敏核兩系不育系包括但不限于安農(nóng)S-1、廣占63S、1892S、Y58S、新安S、新華S、03S、新二S、綠102S、株1S、廣茉S、2301S、綠敏S、63-4S或其同型系及衍生溫敏型核不育系；所述的溫敏型兩系水稻包括水稻溫敏核不育系和以水稻溫敏核不育系為親本選配的雜交組合。

其詳細(xì)步驟按如下所述：

1.CTAB法提取水稻基因組DNA

1.1用于溫敏核不育系的輔助選育的DNA樣品提取