[發明專利]一種動物組織脂肪氧化酶活性的定量檢測方法

有效

• 申請號: 201110326420.5
• 申請日: 2011-10-25
• 公開（公告）號: CN102507488A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 劉永樂;王建輝;王發祥;李向紅;俞健;劉冬敏
• 申請（專利權）人: 長沙理工大學
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 馬強

1.一種動物組織的脂肪氧化酶活性的定量檢測方法，包括如下步驟：

(1)粗酶液和底物液的配制；

所述粗酶液是：待測的動物組織經搗碎后，用磷酸鹽緩沖溶液浸提，再經兩次鹽析、透析純化后得到粗酶液；

所述底物液是：由0.2g～0.3g吐溫-20和0.7mmol～0.8mmol亞油酸在pH值為6.5～7.5的磷酸緩沖液中配制成的底物液；

(2)制備脂肪氧化酶樣品的測定液及對照液，測定吸光度；

將粗酶液中加入底物液中，加入4倍粗酶液體積的無水乙醇終止反應，離心，取上清液加入無水乙醇，并用質量濃度為60％乙醇稀釋成測定液；在同樣反應條件下制備空白對照液，于234nm處測定吸光度；

(3)根據脂肪氧化酶酶活力與吸光度的標準曲線，得出酶活力；

所述標準曲線是按照以下方案得出的：配制一系列不同濃度的脂肪氧化酶標準品酶液，在步驟(2)的同樣反應條件下反應后，配制脂肪氧化酶標準品的測定液及對照液，于234nm處測定吸光度；以吸光度對脂肪氧化酶標準品濃度作圖，得脂肪氧化酶吸光度標準曲線。

2.根據權利要求1所述的動物組織脂肪氧化酶活性的定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中粗酶液的制備過程如下：

選取預冷的動物組織放入絞肉機，于10℃下絞碎，按1∶4(w∶v)比例加入濃度為0.05mol/L、pH值為6.5～7.5磷酸鹽緩沖液勻漿，靜止浸提1h；組織勻漿以8,000r/min離心20min，上清液用40％飽和度的硫酸銨鹽析，然后以8,000r/min離心15min；將所得上清液用70％飽和度的硫酸銨鹽析，以8,000r/min離心30min；用濃度為0.05mol/L、pH值為6.5～7.5的磷酸鹽緩沖液溶解所得沉淀物，在同樣的緩沖液中用截留分子量為25,000的纖維素透析袋透析過夜得到粗酶液。

3.根據權利要求1所述的動物組織脂肪氧化酶活性的定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中底物液的配制過程如下：

將0.2775g吐溫-20加入到10mL?0.05mol/L的pH值為6.5～7.5的磷酸緩沖液中，逐滴加入0.70～0.75mmol亞油酸，混勻，形成乳狀液；再向其中加入1mol/L的NaOH溶液0.65mL，混勻，澄清；然后加入40mL?0.05mol/L、pH值為6.5～7.5的磷酸緩沖液混勻，加水定容至100mL，調整pH值到6.3～6.7；將底物濃度控制在7.0×10^-3mol/L～7.5×10^-3mol/L；以上操作均在10℃以下操作。

4.根據權利要求1所述的動物組織脂肪氧化酶活性的定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體過程如下：

25℃下將粗酶液和底物溶液按1∶10(v∶v)的比例混合，并連續通入氧氣。反應30min后用無水乙醇終止反應，離心；取上清液0.5mL，無水乙醇2mL，質量濃度為60％乙醇溶液7.5mL，分別加入12mL的離心管中配制成測定液，在234nm處測定吸光度值；空白對照液與測定液中粗酶液和底物濃度相同，僅添加順序不同：先在粗酶液0.5mL中加入無水乙醇2mL，靜置數分鐘后加入底物液5mL，混勻后，取反應液0.5mL，用質量濃度為60％的乙醇對測定液和空白液進行稀釋；在234nm處測定吸光度值。

5.根據權利要求1所述的動物組織脂肪氧化酶活性的定量檢測方法，其特征在于，所述步驟(1)中粗酶液的制備前添加1mmoL/L的乙二胺四乙酸和1mmoL/L的二硫蘇糖醇，酶液提取前將動物組織預冷至2℃-8℃，防止提取過程中脂肪氧化酶活性的喪失。