[發明專利]一種抗除草劑莎稗磷的特異性抗體

有效

• 申請號: 201110326286.9
• 申請日: 2011-10-25
• 公開（公告）號: CN103073634A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 王俊平;王碩;生威
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/113;C07K16/44
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.除草劑莎稗磷的人工抗原和抗體其特征在于使用分子式為

的半抗原與牛血清白蛋白連接合成人工抗原，與辣根過氧化物酶連接合成酶標抗原，其中人工抗原再經過免疫新西蘭大耳兔，取血，分離出抗血清純化制得抗體；

2.權利要求1所述的除草劑莎稗磷人工抗原的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得：

(1)N-氯乙酰基-N-異丙基-4-氯苯胺(CCPA)的合成

稱取5.859g?N-異丙基對氯苯胺、28ml無水甲苯、3.57g三乙胺置于圓底燒瓶中，在室溫攪拌下，利用恒壓滴液漏斗向其中逐滴滴加3.92g氯乙酰氯，控制滴加的速度使溫度保持在65℃以下，滴加完畢后，保持溫度在110℃回流5-6h，冷卻，過濾，用苯洗滌生成的三乙胺鹽酸鹽，濾液水洗至中性，無水硫酸鈉干燥，過濾，得到一深色溶液，將深色溶液過硅膠柱純化，收集目標組分并旋蒸掉其中的大部分有機溶劑，室溫冷卻，析出的白色結晶即為N-氯乙酰基-N-異丙基-4-氯苯胺；

(2)半抗原的合成

稱取2.25g氫氧化鈉溶解于18ml水中，向其中加入132.65mg巰基乙酸，攪拌15min后，向其中投入354.24mg的CCPA，回流2h，冷卻，用濃鹽酸酸化至pH＝1.過濾，水洗，得到半抗原的白色固體；

(3)稱取4.568mg半抗原于一棕色小瓶中，加入350μl二甲基亞砜(DMSO)，超聲2h，半抗原溶解后再分別稱取8.711mg?N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、6.242mg?N，N-二環已基碳二亞胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，攪拌反應24h，離心出去沉淀，得到活化酯液；

(4)人工抗原的合成

將上述活化酯液逐滴緩慢地加入到由20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml?pH＝7.4的PBS緩沖液中所配置的溶液中，4℃反應過夜，反應產物于4℃、pH?7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中透析三天，然后精確量取蛋白質偶聯物溶液的體積，測定濃度，分裝，-20℃保存；

3.權利要求1所述的莎稗磷酶標抗原的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得：

稱取1.02784mg半抗原于一棕色小瓶中，加入150μl二甲基亞砜(DMSO)，超聲2h，半抗原溶解，再分別稱取1.96mg?N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1.4045mg?N，N-二環已基碳二亞胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，攪拌反應24h，離心出去沉淀，得到活化酯液；然后準確稱取5mg的辣根過氧化物酶(HRP)溶解于2ml的NaHCO₃溶液中，將上述的活化酯溶液于冰浴中緩慢加入到HRP溶液中，4℃條件下攪拌過夜。后用pH7.4磷酸鹽緩沖液透析3天，加入硫柳汞，4℃冰箱保存；

4.權利要求1所述的除草劑莎稗磷抗體的制備方法，其特征在于是用下述步驟制得：

免疫動物選用雄性新西蘭大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后進行四次加強免疫，加強免疫分別于初次免疫后2周、4周，6周和8周后免疫四次，免疫后9天由兔子的耳緣靜脈取血，進行效價檢測，具體做法是：

初次免疫：取1mg按照權利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所配制的溶液中，進行動物免疫；

加強免疫：用0.5mg上述人工抗原溶于0.9％的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體積所配制的溶液，進行動物免疫；

抗體純化：定時監測動物抗體效價，當抗體對一定的包被抗原達到適宜效價時，采集血液，并離心獲得抗血清，使用G-Sepharose蛋白親和層析柱對抗血清進行純化，獲得抗莎稗磷的特異性抗體。