[發明專利]一種具有低溫活性和耐鹽性的甘露聚糖酶及其基因

有效

• 申請號: 201110326253.4
• 申請日: 2011-10-25
• 公開（公告）號: CN102311944A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發明（設計）人: 黃遵錫;周峻沛;高雅潔;王鳳;唐湘華;李俊俊;許波;潘璐
• 申請（專利權）人: 云南師范大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/19;C12N1/21
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責任公司 53100
• 代理人: 金耀生

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體地說是一種具有低溫活性和耐鹽性的甘露聚糖酶ManAjb13及其基因。

背景技術

甘露聚糖是一種豐富的半纖維素，由吡喃甘露糖以β-1,4?糖苷鍵連接而成，廣泛存在于高等植物中，如豆科植物的種子、魔芋的球莖、蘭科植物的假鱗莖、稱猴桃的莖葉中等。甘露聚糖的降解主要依靠內切甘露聚糖酶（β-mannanase；endo-1,4-β-D-mannanase，EC?3.2.1.78），降解產物為甘露糖或甘露寡糖。根據氨基酸序列同源性，內切甘露聚糖酶主要歸類于糖苷水解酶第5和26家族，其可來源于細菌、放線菌及真菌等（Finn?et?al.,?Nucleic?Acids?Res,?2008,?36:?D281–D288.）。

內切甘露聚糖酶在飼料、食品、醫藥、紡織、造紙、石油開采等領域都具有應用價值。飼料中添加甘露聚糖酶，可顯著降低甘露聚糖分子大小，從而改善飼料性能、消除或降低因粘度增加而引起的抗營養作用并提高免疫力（Dhawan?and?Kaur,?Crit?Rev?Biotechnol,?2007,?27:?197–216.）。具有低溫活性的內切甘露聚糖酶制劑可應用于低溫生境和低溫加工過程。水產動物體溫隨水溫或氣溫變化而變化，一般在10–20℃（Zhou?et?al.?Appl?Microbiol?Biotechnol,?2009,?85:?323–333.）。因此，水產飼料中應用的內切甘露聚糖酶需要在此低溫（10–20℃）環境下具有催化活性。另一方面，大多數水產動物消化道環境呈中性（如鯉科魚類）并含中性內源蛋白酶，水產飼料中添加的外源內切甘露聚糖酶需在中性條件下具有催化活性，并對中性蛋白酶具有抗性。再一方面，海洋魚類適于生長在高鹽環境中（如石斑魚最佳養殖鹽度為25–33），飼用海洋魚類的內切甘露聚糖酶需要具有耐鹽性。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有低溫活性和耐鹽性的甘露聚糖酶ManAjb13。?

本發明的再一目的是提供編碼上述甘露聚糖酶的基因。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。

本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

本發明所述甘露聚糖酶ManAjb13可得自鞘氨醇單胞菌（Sphingobium?sp.）。ManAjb13的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.?1所示。

甘露聚糖酶ManAjb13總共含396個氨基酸，其中N端38個氨基酸為其預測的信號肽序列“MIARRFSNLPESCGAIRSSFFCAIILLAGCGPLGRPNA”，成熟的甘露聚糖酶ManAjb13含358個氨基酸。

本發明通過PCR的方法分離克隆了甘露聚糖酶ManAjb13的編碼基因manAjb13，其全長1191bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA。該基因序列如?SEQ?ID?NO.?2所示。經BLAST比對，該甘露聚糖酶基因manAjb13編碼的氨基酸序列與GenBank中Rhodothermus?marinus?SG0.5JP17-172來源的潛在甘露聚糖酶（AEN72408）具有最高的一致性，為56.2%；與確證活性的Cellvibrio?Japonicus來源甘露聚糖酶Cjman26c（2VX4_A）的一致性為44.4%。

本發明還提供了包含上述甘露聚糖酶基因manAjb13的重組載體，優選為pET-manAjb13。將本發明的甘露聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，將本發明的甘露聚糖酶基因插入到質粒pET-28a（+）上的EcoRI和XhoI限制性酶切位點之間，得到重組大腸桿菌表達質粒pET-manAjb13。

本發明還提供了包含上述甘露聚糖酶基因manAjb13的重組菌株，優選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優選為重組菌株BL21(DE3)/manAjb13。

本發明制備甘露聚糖酶ManAjb13的方法按以下步驟進行：

1）用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；

2）培養重組菌株，誘導重組甘露聚糖酶表達；

3）回收并純化所表達的甘露聚糖酶ManAjb13。