[發明專利]一種眼鏡蛇蛇毒神經毒素的提純方法、提取物及其制劑

無效

• 申請號: 201110324792.4
• 申請日: 2011-10-24
• 公開（公告）號: CN102351951A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 竇啟玲;蘇凱
• 申請（專利權）人: 貴州益佰制藥股份有限公司
• 主分類號: C07K14/465
• 分類號: C07K14/465;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;A61K38/17;A61K35/58;A61P25/04;A61P29/00
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技術領域

本發明屬于生物醫藥提取技術領域，特別是涉及一種眼鏡蛇蛇毒神經毒素的提純方法、提取物及其制劑。

背景技術

蛇毒是毒蛇從毒腺中分泌出來的一種液體，主要成份是毒性蛋白質，約占干重的90％至95％。酶類和毒素約含二十多種。此外，還含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、脂類、核苷、生物胺類及金屬離子等。蛇毒成分十分復雜，不同蛇毒的毒性、藥理及毒理作用各具特點。就眼鏡蛇蛇毒而言，含有細胞毒素(Cytotoxin，CTX)、神經毒素(neurotoxin，NT)，神經生長因子(Nerve?growth?factor，NGF)和多種酶類等。神經毒素(neurotoxin，NT)在蛇毒中含量較高，一般在20％～50％之間，毒性極強，是該類毒蛇咬傷致死的主要成分之一。

蛇毒神經毒素種類多、活性強、性質穩定、結構相對簡單，因此一直備受人們的關注。近年來隨著生化技術的發展及分子生物學方法的應用，已經從不同的蛇毒中分離純化出許多的神經毒素。其中僅突觸后神經毒素就有100多種。蛇毒神經毒素根據作用機制可分為四類：突觸前神經毒素(presynaptically-acting?neurotoxin或βα一neurotoxin)、突觸后神經毒素(postsy-naptically-acting?neurotoxin或a-neurotoxin)、抗膽堿酯酶類神經毒素(anticholinesterase?neurotoxin)和離子通道型神經毒素(ion-channel?neurotoxin)。目前發現的鎮痛成分幾乎都是突觸后神經毒素。

科學研究表明，突觸后神經毒素是一條由60～80個氨基酸殘基組成的多肽鏈，氨基酸殘基的組成及相對位置具有很大的同源性，分子量約為6000～8000道爾頓。突觸后神經毒索有長鏈和短鏈之分，短鏈含60～62個氨基酸，四個二硫鍵.長鏈含66～74個氨基酸，五個二硫鍵。分子中的二硫鍵聚集在一起形成一個致密的內核，由此核心伸展出三個肽鏈環就象三個手指，故其又被形象地稱為三指蛋白(three-ringer?protein)。突觸后神經毒素幾乎全部是堿性蛋白，等電點在9～10之間。由于分子量很小但二硫鍵很多，這類毒素的理化性質十分穩定，對熱及化學試劑都有抗性。

1936年Macht提出肌肉注射微量眼鏡蛇毒具有類似嗎啡的中樞鎮痛作用。美國Hynson，Westcott&Dunning公司對眼鏡蛇粗毒進行初步分離，制成Cobroxin和Nyloxin兩種神經毒素制劑，用于治療頑固性疼痛、惡性腫瘤疼痛和關節痛，這兩種藥物已列入美國藥物局方中。我國自1952年起開展對蛇毒神經毒素的鎮痛作用研究，開發了一些制劑用于臨床治療疼痛，其中中國科學院昆明動物研究所研制的“克痛靈”注射劑(現名為科博肽注射液)，用于治療坐骨神經痛、三叉神經痛、神經血管性頭痛以及風濕痛等頑固性疼痛，療效顯著且副作用少。NT的鎮痛作用有別于阿片類藥物，表現為作用效價高，維持時間久，無耐受性和成癮性，是一種很有潛力的新型鎮痛藥。同時，NT還能戒除嗎啡毒癮，在戒毒方面有獨特的治療作用。

目前，獲取眼鏡蛇蛇毒中的神經毒素主要是通過捕蛇或養蛇取毒，對粗毒進一步純化提取而得到，主要利用離子交換層析和凝膠層析。現有技術中，中國專利申請CN101845089A(公開日期2010年9月29日)公開了“一種適合規模化生產眼鏡蛇蛇毒神經毒素并降低神經毒性的方法”，該方法將蛇毒層析洗脫后再過分子量為3K的超濾膜最后采用過氧化氫修飾神經毒素，步驟較繁瑣，容易引入雜質，在實際生產中，蛇毒神經毒素在層析洗脫后仍存在一部分分子量大于神經毒素的至敏物質，且采用過氧化氫修飾神經毒素后對眼鏡蛇神經毒素的長期穩定性并未作考察，規模化生產出的成品距離產品實際運用中仍然需要一定的考察時間。李范珠等在文獻“浙江眼鏡蛇蛇毒中神經毒素的分離純化及其鎮痛作用研究”(中國藥師，2004年09期，P659～661)中公開的浙江眼鏡蛇蛇毒中神經毒素的分離純化方法為將蛇毒直接進行三次柱層析，耗時長，提取成本高，神經毒素的收率較低。龔潮梁等在“一種分離提純眼鏡蛇_Najanajaatra_神經毒素的簡便方法”(動物學研究，第2卷第4期增刊，1981年11月)一文中公開了采用CM-纖維柱層析分離神經毒素，70℃保溫熱變性處理雜質，低溫冷丙酮提純，然后用Sephadex?G-10脫鹽的方法獲得純化的眼鏡蛇毒神經毒素，但是高溫保溫容易引起神經毒素大量變性沉淀，導致產物的生物活性降低，另外，由于鹽在目標產物中的量較少且不會影響其活性，脫鹽會導致有效成分損失，且操作繁瑣，實際生產中耗費人力物力，使生產周期變長。