[發明專利]測定糖化蛋白質的組合物

有效

• 申請號: 201110324779.9
• 申請日: 2002-01-30
• 公開（公告）號: CN102899388A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 高妻卓司;芳陵一生;荒井基夫;炭谷順一;今村茂行
• 申請（專利權）人: 旭化成制藥株式會社
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;C12Q1/25
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 龐東成

本申請是中國專利申請02806704.5(其分案申請的申請號200810144943.6)的分案申請，原申請的申請日是2002年1月30日，發明名稱是“測定糖化蛋白質的組合物”。

發明領域

本發明涉及一種用于測定糖化蛋白質的組合物和一種測定糖化蛋白質的方法。可將本發明用于測定糖化蛋白質的組合物和方法應用于臨床檢查，其能夠精確地測定糖化蛋白質。

發明背景

在糖尿病的診斷和控制中測定糖化蛋白質是非常重要的。對能夠反應過去約1至2個月的平均血糖值的糖化血紅蛋白(GHb)，能反應過去約2周的平均血糖值的糖化清蛋白(GA)，一般地指示血清中具有還原能力的糖化蛋白的果糖胺(FRA)等可每天進行測定。GHb是血紅蛋白的糖化產物，即在血紅蛋白β-鏈上N-末端纈氨酸的α-氨基基團被糖化。GA和FRA分別是清蛋白和血清蛋白的糖化產物，即清蛋白或血清蛋白的賴氨酸殘基上的ε-氨基基團被糖化。

酶學方法是一種簡易且便宜的精確測定糖化蛋白質的方法。日本專利申請公開No.6-46846，No.5-192193，No.2-195900和No.2-195899，以及國際專利申請公布號WO98/48043和WO97/13872是公開此酶學方法的文獻實例。

然而，為提供一種精確測定糖化蛋白質的組合物，有必要1)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響以及2)使蛋白酶和能夠至少與糖化氨基酸反應的酶保持穩定。此外，如果糖化蛋白是糖化清蛋白，則3)精確測定清蛋白和4)消除糖化血紅蛋白的影響也很重要。

1)消除球蛋白組分和抗壞血酸的影響的常規方法

已知糖尿病患者的球蛋白的量能夠改變和影響FRA的值[Rodrigues，S.等，臨床化學(Clin.Chem.)35：134-138(1989)]。本發明人研發了一種方法，其中通過向蛋白酶反應液中加入特定金屬離子和蛋白質A或G可選擇性地抑制蛋白酶對球蛋白組分的作用(日本專利申請No.11-231259)。利用此發明的方法，可以測定糖化蛋白而不會受到球蛋白組分的影響。應用于此方法中的球蛋白選擇性蛋白酶抑制劑可提及的有金屬、蛋白A和蛋白G。在此專利申請所述的金屬中，強效金屬是那些可能會導致環境安全問題的重金屬。而弱效金屬如果與其它試劑(或組合物)結合可能導致試劑溶液渾濁。另外，蛋白A和蛋白G都是非常昂貴的試劑。

作為選擇性吸附血液中球蛋白的方法，已知血液處理劑利用色譜學原理以及具有類固醇骨架的引入了配體的乙烯共聚物可對血液中的內毒素和球蛋白進行吸附(日本專利申請公開No.61-94663)。然而，在日本專利申請公開No.61-94663的實施例中附表1所示的結果表明只有α1-球蛋白和α2-球蛋白被證明可被吸附，而占球蛋白組分70％或更多的γ-球蛋白不能被吸附。假設γ-球蛋白被吸附，則不會期望血液處理試劑具有抑制蛋白酶對γ-球蛋白的作用的能力。

近年來，大量抗壞血酸作為增補物被攝取的情況越來越多。含有高濃度抗壞血酸的臨床樣品也在增加。抗壞血酸由于具有強還原性而對臨床檢查造成多種影響。

作為消除抗壞血酸影響的方法，已知可通過化學或利用抗壞血酸氧化酶的酶學方法去除樣品中的抗壞血酸。從對顯色系統引起較小影響來考慮，當利用至少與糖化氨基酸反應的酶對利用蛋白酶斷裂糖化蛋白質所產生的糖化氨基酸進行檢測時，優選預先地在與蛋白酶反應時利用抗壞血酸氧化酶(ASOx)去除抗壞血酸的方法。

作為蛋白酶存在時利用ASOx去除樣品中抗壞血酸的實例，對在pH8.0的2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸(HEPES)緩沖液中使ASOx與樣品溶液反應的實驗已有報道(Clinical?Chemistry(臨床化學)，27：99-106，1998)。文獻報道經過兩周的冷藏后處理抗壞血酸的能力沒有變化。

然而，本發明人的研究表明當HEPES緩沖液(pH8.0)、蛋白酶和ASOx存在時，在37℃下貯藏一天或在10℃下貯藏兩周后抗壞血酸處理能力已經幾乎完全喪失。

2)用于穩定蛋白酶和至少與糖化氨基酸反應的酶的現有技術

用于糖化蛋白質的臨床檢測的蛋白酶溶液具有在其它領域如食品業中無法見到的極高濃度。已知蛋白酶在水溶液中能進行自消化。難以想象蛋白酶能以如此高濃度在水溶液中保持穩定。因此，在用于鑒定糖化蛋白的組合物中使用的蛋白酶以凍干產物形式提供。