[發明專利]一種分離牛外周血單核細胞的方法

無效

• 申請號: 201110324701.7
• 申請日: 2011-10-21
• 公開（公告）號: CN102329774A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 周向梅;趙德明;林敬鈞;王洋;楊利峰;尹曉敏
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及細胞分離技術，具體地說，涉及一種分離牛外周血單核細胞的方法。

背景技術

分離外周血單核細胞一般包括兩個步驟：即外周血單個核細胞的分離和后續單核細胞的分離。其中，第一步是通過密度梯度離心完成的，通過選擇一定密度的分離液，可以將血液中密度較低的單核細胞和淋巴細胞(二者密度相近，合稱外周血單個核細胞，PBMC)與密度較高的粒細胞、紅細胞成分分開；第二步，單核細胞可以用其它一些方法與淋巴細胞分離開，包括吸附法、免疫分選、反向淘選離心法和密度梯度分離等。其中，吸附法是最常用的方法，它簡單、經濟，但是也存在一些缺點，比如淋巴細胞污染量高、靈活性低、工作量大、單核細胞激活等。免疫分選對于日常應用以及處理大量血液樣本而言十分昂貴，需要專門的單克隆抗體和設備，一般包括流式細胞術和免疫磁珠兩種方法。反向淘選離心法可以處理大量的血液，純度高活率高，而且不易激活單核細胞，但是需要昂貴的設備和專業的技術人員。密度分離的方法包括使用連續密度梯度和非連續密度梯度兩種，其中制作連續密度梯度的泵和超速離心機價格相對昂貴。

1999年，Jindrich?Soltys等人使用了免疫磁珠的方法分離牛的中性粒細胞，細胞得率更高、純度更純，而且在諸多檢測指標中都表現出了更好的活性，但是用免疫磁珠法分離牛外周血單核細胞還未有文獻報道。使用抗體的單核細胞分離技術還有流式細胞術，但是也沒有用于分離牛外周血單核細胞的文獻報道。反向離心淘洗法需要一套專門的反向離心淘洗設備，用于人的外周血單核細胞分離，但也沒有文獻使用了該技術分離牛的外周血單核細胞。密度分離的方法是基于單核細胞和淋巴細胞的大小不同，使用連續密度梯度分離液和超速離心機將二者分開，目前該方法也不常用牛的外周血單核細胞分離。

發明內容

本發明旨在克服現有技術的不足，對塑料吸附法分離牛外周血單核細胞的關鍵步驟進行改進，提供一種優化的分離牛外周血單核細胞的方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種分離牛外周血單核細胞的方法，包括步驟：1)向含有抗凝劑ACD-A的離心管中加入采集到的牛外周血，制成抗凝血液；2)將OptiPrep^TM原液與C液按比例混合，制成密度分離液；3)將1)的抗凝血液與PBS液按比例混合，制成稀釋的抗凝血液；4)將2份體積的3)稀釋的抗凝血液加在1份體積的2)的密度分離液之上，離心，棄上清，將分離液和血清液面交界處的白色薄層轉移至另一離心管中；5)向4)的離心管中加入PBS溶液清洗細胞，然后以轉速250g離心5-10min；重復5)一次；6)向5)的細胞沉淀中加入PBS溶液重懸，即得單個核細胞。

其中，前述2)和3)中C液的制備方法為：將1.79g?Tricine?Buffer加入100ml水中，制得100mM?Tricine儲存液，4℃保存；將0.85g?NaCl加入50ml水中，加入20ml?100mM?Tricine儲存液，用1M?NaOH調節pH值7.4，加水補充體積至100ml，0.22μm濾器過濾除菌。

前述步驟1)中所述的抗凝劑ACD-A的制備方法為：向100ml水中加入0.73g無水檸檬酸、2.20g二水檸檬酸鈉和2.45g一水右旋糖，調節pH值至7.0-7.3，0.22μm濾器過濾除菌。其中，抗凝劑ACD-A和牛外周血的體積比為1∶5-10。

前述步驟2)中OptiPrep^TM原液與C液的體積比為1.4∶4.6。

前述步驟3)中抗凝血液與PBS液的體積比為1∶1。

前述的方法還包括以下步驟：將6)的細胞懸液轉移至細胞培養瓶中，加入RPMI1640培養基，然后將細胞培養瓶置于37℃，5％CO₂的條件下培養，得到貼壁的單核細胞。

本發明采用了新型的密度梯度分離液OptiPrep^TM，它是一種非離子型等滲造影劑，可以配置的密度范圍寬，而且它不像Percoll^TM含有固態顆粒，后者可能會被單核細胞吞噬，而且內毒素含量很低(高濃度Ficoll^TM可能含有較高的內毒素含量)，對敏感的單核細胞損傷和影響很小。本發明是以OptiPrep^TM說明書為基礎，參考了其它關于牛和人的單核細胞分離技術的文獻，經過反復實驗和不斷摸索而設計得到的，將說明書和部分文獻中對實驗有利的步驟保留，剔除不利的步驟。