[發明專利]一種SIV載體的制備方法

無效

• 申請號: 201110324532.7
• 申請日: 2011-10-24
• 公開（公告）號: CN103060378A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 朱義;游軍;朱亞峰;長谷川戶
• 申請（專利權）人: 四川百利藥業有限責任公司;日本DNAVEC株式會社
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種SIV載體的制備方法。?

背景技術

SIV（Simian?Immunodeficiency?Virus）即猴免疫缺陷病毒，SIV載體是一種基于猴免疫缺陷病毒（SIV）的載體。?

目前，常見的SIV載體的制備方法是磷酸鈣共沉淀轉染法，該方法受pH的值變化的影響比較大。該制備方法工藝復雜，生產效率低，無法滿足大規模工業化生產的要求。?

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術中存在的不足，提供一種SIV載體的制備方法。該制備方法構思巧妙、流程簡單，生產成本低，生產效率大幅提高，滿足了SIV載體大規模工業化生產的要求。?

為實現上述目的，本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：?

一種SIV載體的制備方法，將培養皿用膠原蛋白進行處理，在轉染過程中使用Opti-MEM培養基，在轉染過程中增加DNA濃度。

本發明通過優化SIV載體生產時的轉染條件，獲得原有技術約2倍的SIV載體生產量，達到事半功倍的效果，對促進SIV載體的實用化具有重大意義。具體包括：1)?使用Collagen處理過的培養皿提高SIV載體生產量的技術；2)?轉染時使用Opti-MEM培養基提高SIV載體生產量的技術；3)?轉染時增加DNA濃度提高SIV載體生產量的技術。?

本發明的有益效果在于：本發明構思巧妙、流程簡單，生產成本低，生產效率大幅提高，可以實現SIV載體的大規模工業化生產。?

附圖說明

本發明將通過例子并參照附圖的方式說明，其中：?

圖1是本發明實施例1生產量評價結果圖；

圖2是本發明實施例2生產量評價結果圖；

圖3是本發明實施例3生產量評價結果圖；

圖4是本發明實施例4生產量評價結果圖。

具體實施方式

本說明書中公開的所有特征，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。?

實施例1：選用3個直徑10cm的普通培養皿(dish)和3個Collagen-Type?I處理過的同尺寸培養皿，采用相同方法進行SIV-GFP的生產，比較使用兩種培養皿在SIV載體生產性上的差別。?

具體方法為：(DNA?32μg?+1.5ml?2xBES?Buffer)和1.5ml?167mM?CaCl₂混合20分鐘后與12ml?DMEM培養基混合，5ml/dish分別加入3個長有293T/17細胞(添加前用DMEM洗一遍細胞)的培養皿中，3小時后以5ml/dish加入含20%FBS的DMEM培養基過夜培養，第2天去掉培養液，用DMEM洗一遍后，以10ml/dish加入含10mM?NaB的DMEM過夜，轉染48小時后收取上清，檢測SIV-GFP的滴度。?

現有技術中使用普通細胞培養瓶進行SIV載體的生產，本發明使用Collagen處理培養皿可以改善細胞生長狀態，有利于提高SIV載體的生產量。實驗結果表明，使用Collagen處理過的培養皿進行SIV載體的生產可以提高約30%的生產量。?

實施例2：選用直徑10cm的普通培養皿(3個／組)，采用同樣條件配制DNA混合物，將DNA混合物分別和DMEM培養基，IMDM培養基，Opti-MEM培養基這3種不同培養基混合后添加進培養皿來進行SIV-GFP的生產，比較轉染時使用不同培養基在SIV載體生產性上的差別。?

現有技術中使用DMEM培養基進行轉染，具體方法同實施例1。磷酸鈣共沉淀轉染法受pH的變化的影響比較大，使用pH較穩定的培養基可改善轉染效率，從而有利于提高SIV載體的生產量。Opti-MEM是Invitrogen公司開發的培養基，pH比較穩定，可以廣泛用于各種轉染試劑的轉染。實驗結果發現轉染時使用Opti-MEM進行SIV載體的生產可以提高約40%的生產量。?

實施例3：選用直徑10cm的普通培養皿(3個／條件)，分別采用不同條件(1倍?DNA濃度，1.5倍?DNA濃度，2.0倍?DNA濃度)配制DNA混合物，將DNA混合物和DMEM培養基混合后添加進培養皿來進行SIV-GFP的生產，具體方法同實施例1。比較轉染時使用不同DNA濃度在SIV載體生產性上的差別。?