[發明專利]蛋白抗原多個多肽抗原表位偶聯載體生產抗體的方法

無效

• 申請號: 201110324423.5
• 申請日: 2011-10-24
• 公開（公告）號: CN102391375A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 李學斌
• 申請（專利權）人: 武漢伊艾博科技有限公司
• 主分類號: C07K16/06
• 分類號: C07K16/06;C07K1/22
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 涂潔

技術領域

本發明屬于蛋白抗原的多克隆抗體生產技術領域，具體的說是一種蛋白抗原多個多肽抗原表位偶聯載體生產抗體的方法。

背景技術

抗體是免疫學檢測中重要的工具，其主要制備方法是通過抗原免疫動物激發機體產生免疫球蛋白(簡稱抗體)，然后通過提取純化制得抗體以用于免疫學檢測或作物治療性藥物使用，抗原生產的方法主要包括人工提取天然抗原和人工合成制備完全抗原兩種。人工提取的天然抗原天然立體構象好，能更好的刺激動物機體產生免疫反應，獲得的抗體具有效價高、親和力高的優點，但由于很多天然抗原在自然界天然狀態下存量極微，人工提取極為困難，提純成本高，因此人工提取天然抗原難以得到有效推廣；而目前人工合成制備完全抗原特別是蛋白抗原，主要通過多肽合成或重組蛋白來實現，重組蛋白的技術目前還受到技術的制約，表達成功率不高，僅為20％甚至更低；單一多肽合成技術由于肽鏈較短，導致免疫原性不好，另外由于蛋白序列的多樣性，很容易與其它蛋白有序列重復，造成生產出來的抗體特異性不好。另外還有一種基因工程免疫法由于基因工程免疫法很少用于抗體的制備，并且需要借助分子生物學平臺，并且成功率低，抗體效價低，目前僅僅停留在實驗室階段。

發明內容

本發明的目的是為了解決上述技術問題，提供一種蛋白抗原多個多肽抗原表位偶聯載體生產抗體的方法，其方法簡單、成本低、周期短、制得的抗體效價高。

本發明方法包括

(1)抗原表位選取與合成：選取具有至少2個有效多肽表位的蛋白抗原，然后根據該蛋白抗原的至少2個有效多肽表位的多肽序列分別合成至少2種多肽。

(2)多種多肽與載體的偶聯：將合成的至少2種多肽與載體進行偶聯制備出完全抗原，同一載體上同時偶聯有至少2種多肽，每種多肽的摩爾數大于載體摩爾數；

(3)動物免疫及其檢測：將上述完全抗原進行動物免疫，并采用酶聯免疫吸附分析法檢測動物免疫效果，得到相應的ELISA效價不低于1∶100,000的動物免疫血清；

(4)抗原親和層析提取：將上述動物免疫血清通過天然抗原親和層析方法提取出針對上述蛋白抗原的抗體。

所述步驟(2)中，每種多肽與載體的摩爾比為5-15∶1，優選為10∶1。

所述具有至少2個有效多肽表位的蛋白抗原的選取可根據蛋白抗原的性質進行篩選獲取，或通過已發表的文獻數據獲得，然后將獲知的多肽序列人工合成為多肽，需要幾個有效多肽表位就可分別合成對應的幾種多肽。

步驟(2)中的的載體可根據具體生產的蛋白抗體進行合理選擇，如常用的牛血清白蛋白，卵清白蛋白或血藍蛋白等。

將含有兩個以上抗原表位的蛋白抗原的多肽表位分別合成出來后，然后將上述至少2種多肽經化學偶聯到載體上，同一載體上可偶聯多種多肽，如合成了4種多肽，則同一載體上同時偶聯有4種多肽，并且每種多肽的數量大于載體數量(即同一載體上的同種多肽的數量大于1，優選每種多肽與載體的摩爾比為5-15∶1)，通過化學偶聯后得到的完全抗原經免疫動物制備動物抗血清，再通過親和層析提純獲得針對完全抗原的抗體。由于本發明的抗體制備方法中抗原通過至少2個多肽表位人為富集和多樣化(即同一載體上偶聯了多種多個多肽)，具有了一定的立體構象，并起到了一個協同放大效應，所以其抗體的免疫效果較單一表位多肽和重組蛋白免疫方法以倍數增加，從而得出的抗體效價高于單一表位多肽和重組蛋白免疫方法，更為接近通過天然抗原蛋白獲得的抗體，這是單一表位多肽和重組蛋白免疫所無法模擬和達到的。

本發明方法(下稱A法)生產的抗體比傳統天然抗原免疫法(下稱B法)相比，成本低，抗原容易取得，但是抗體效價稍有遜色；與重組蛋白免疫法(C法)相比，抗原制備簡便，生產周期短(比C法生產周期短2周)、效價高；與傳統單一多肽免疫法(D法)相比，抗體生產周期縮短，效價更高，抗體特異性好。

附圖說明

圖1為本發明的技術流程圖；

圖2采用本法生產的抗體效價比較曲線圖。

具體實施方式

下面以制備人次級淋巴小結激酶蛋白(Germinal?Center?Kinase，以下簡稱GCK)為例對本發明作進一步的闡述，但是不作為本發明內容的限制。

一、抗原表位的挑取：