[發明專利]參與神經干細胞分化的基因鑒定及應用

無效

• 申請號: 201110323636.6
• 申請日: 2011-10-24
• 公開（公告）號: CN103060328A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 田杰
• 申請（專利權）人: 北京清美聯創干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于再生醫學領域，涉及神經干細胞分化的基因和遺傳工程，以及利用這些基因及其產物作為干細胞分化的調控靶標。

背景技術

人類基因組測序已全部完成，探究浩如煙海的基因的功能是目前生物醫學面臨的重大挑戰。這些基因功能的鑒定對于揭示包括神經干細胞分化機理在內的生命過程具有理論意義，更重要的是對神經退行性疾病的治療具有臨床意義。

神經干細胞是指具有分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞的能力，并能進行自我更新、足以提供腦組織細胞的可再生細胞。在哺乳動物中樞神經系統發育，保持中樞神經系統的功能具有重要作用。神經干細胞分化是一個極為復雜的過程。影響神經干細胞分化的因子很多，如CNTF(睫狀神經營養因子)能促進神經干細胞分化為膠質細胞，而BDNF(腦源性神經營養因子)則促進干細胞分化為神經元。

對參與神經干細胞分化的基因的研究，為進一步探討神經元的發生、分化和多種神經疾病的診治提供了新機會。神經干細胞的分化受控于相關基因的表達，從全基因組層面研究神經干細胞分化特異基因表達的調控有助于形成對神經干細胞發育、分化的整體認識，進而加深對這一過程的分子機制的理解。

發明內容

本發明的目的在于提供參與神經干細胞分化過程的基因。本發明的另一個目的是提供檢測這些基因表達調控的方法，包括檢測基因是否表達和相對表達水平，并提供以這些基因及其編碼產物為靶標，調控神經干細胞分化的方法。

本發明包括下列步驟：尋找神經干細胞分化過程中差異表達的基因；研究這些基因所在的特定信號傳導途徑；異源表達這些基因；將這些基因及其產物作為靶標，控制神經干細胞的分化。具體包括以下方案：

1.神經干細胞的分離和培養

從孕鼠(14天)紋狀體分離神經干細胞，置于培養液中。[DMEM/F12(1∶1，V∶V)，谷氨酰胺(2mmol/L)，青霉素(100U/mL)，B27(2％)]，細胞種植濃度為1X10⁶/mL，37℃，5％CO₂培養。

2.RNA分離

用SK311?Trizol?RNA?isolation?kit分離細胞→Trizol?1mL→氯仿200uL→振蕩30s→4℃，12000g離心5分鐘→加入等體積異丙醇→70％乙醇洗二次，干燥→0.1％DEPC水，3倍體積無水乙醇，-70℃保存。

3.微矩陣分析

總RNA→cDNA→與人類基因(14000)雜交分析。

圖像分析軟件：Array?Guage?software；

基因功能分析：PubMed(NCBI)，Drosophila?BanR。

4.新功能基因的克隆

將獲得的差異表達基因克隆至T-vector及表達載體。

通過與人類14000個基因雜交分析，共有1406個基因差異表達，148個基因呈現2倍以上差異，60個基因呈現3倍以上差異，新功能序列46個。

具體實施方式

實施例1

神經干細胞的分離和培養

從孕鼠(14天)紋狀體分離神經干細胞，置于培養液中。[DMEM/F12(1∶1，V∶V)，谷氨酰胺(2mmol/L)，青霉素(100U/mL)，B27(2％)]，細胞種植濃度為3X10⁶/mL，37℃，5％CO₂培養。

RNA分離

用SK311?Trizol?RNA?isolation?kit分離細胞→Trizol?1mL→氯仿200uL→振蕩30s→4℃，12000g離心5分鐘→加入等體積異丙醇→70％乙醇洗二次，干燥→0.1％DEPC水，3倍體積無水乙醇，-70℃保存。

微矩陣分析

a)總RNA→cDNA→與人類基因(14000)雜交分析。

b)圖像分析軟件：Array?Guage?software；

c)基因功能分析：PubMed(NCBI)，Drosophila?BanR。

部分差異表達的基因列表