[發明專利]一種可以抑制腫瘤新生血管形成的融合蛋白及其生產工藝

無效

• 申請號: 201110322393.4
• 申請日: 2011-10-20
• 公開（公告）號: CN102358755A
• 公開（公告）日: 2012-02-22
• 發明（設計）人: 刁勇;黃曉平
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/20;C12P21/02
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 陳雪瑩

技術領域

本發明涉及分子藥物學，生物技術和疾病防治，具體地說是采 用中國倉鼠卵巢細胞(CHO)生產一種抗腫瘤新生血管形成的長效重 組蛋白，該蛋白為人Kallistatin(Kal)與人絨毛膜促性腺激素 (hCG)β鏈的羧基末端肽(CTP)的融合蛋白(LA-Kal，long?acting? Kal)。融合蛋白LA-Kal較野生型Kal的體內半衰期顯著增加，提 高了抗腫瘤療效。

背景技術

目前惡性腫瘤已經成為發達國家和地區居于前列的致死性疾 病。雖然外科手術，放療和化療作為的常規治療手段仍在不斷發展， 但由于其固有的局限，其療效已基本達到極限，因而迫切需要開發 新的治療手段。

自從Folkman于1971年首次闡述腫瘤與新生血管依賴關系，并 提出有關分子機制假說以來，以腫瘤新生血管為靶點的抗血管生成 治療成為抗腫瘤研究的熱點。

Kal是一新型的具有抗血管生成作用的內源性蛋白(Miao?RQ， et?al.Blood?2002；100：3245-52)，其抗血管生成作用與內皮抑 素(endostatin)類似。內皮抑素通過其肝素結合活性介導其對血管 生成的抑制作用。各種生長因子必須結合細胞表面兩種不同的受體， 才能引發一個信號。硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)是最普通的低吸附受 體，在調節多種生長因子的作用時，發揮關鍵作用。許多生長因子， 如VEGF和bFGF是肝素結合生長因子，VEGF和bFGF與內皮細胞表 面的HSPGs結合，可以調節它們與專屬受體的結合。Kal是肝素結 合蛋白，可以與VEGF和bFGF，以及其它含有肝素結合區的生長因 子競爭結合HSPGs，因此阻斷了這些生長因子與HSPGs的結合，阻斷 了這些生長因子引發的血管生成事件。另外，Kal還是絲氨酸蛋白酶 抑制劑的一員，最初被認為是組織胰激肽原酶結合蛋白。越來越多 的證據顯示，組織胰激肽原酶在腫瘤相關事件中非常重要，其中包 括腫瘤生長調節，血管生成，侵入和轉移等。我們的研究發現，在 Kal的作用下，HCC中作為細胞增殖的標志Ki-67染色降低，顯示Kal 與組織胰激肽原酶的結合可能與HCC細胞增殖抑制有關。Kal可以從 不同途徑抑制血管生成，因此是抗腫瘤血管生成治療的良好候選者。

已進行的Kal的抗腫瘤作用研究主要采用基因治療手段，而基 因治療一般需要采用病毒載體，其長期應用的風險是各國衛生部門 重點關注的問題，目前尚不明朗，很難在短期內實現上市并廣泛應 用于腫瘤病人。而多種重組蛋白藥物已廣泛地應用于臨床，相關技 術比較成熟，是開發基因重組藥物最常規的手段。Kal的發現者Chao 等曾采用大腸桿菌表達Kal重組蛋白，但表達量很低。本課題組也 曾用大腸桿菌表達人Kal蛋白，表達水平也極低，且雜蛋白多難以 純化。畢赤酵母表達系統是近年來建立起來的一種真核表達系統， 已成功地表達了大量的重組蛋白，它既具有原核表達系統繁殖快、 操作簡單的優點，同時又具有原核表達系統所沒有的優勢：如能對 表達的目的蛋白進行正確加工、折疊及適度糖基化，分泌表達的雜蛋 白少，易于分離純化等，因此越來越廣泛地用于重組蛋白的表達。 本發明人曾利用畢赤酵母表達人Kal蛋白(刁勇，專利申請號 2009102632240)。但野生型Kal在體內較短的半衰期(1-2小時)， 極大地限制了其藥效的發揮，在臨床應用時必須連續反復注射給藥， 病人依從性較差。因此，開發長效蛋白藥物成為研究人員努力的方 向。

由于蛋白質藥物在體內會被快速清除，所以患者必須頻繁用藥 才能保持藥物濃度在治療窗內，限制了其治療效果。因此，延長蛋白 質藥物體內的半衰期已成為近年來的研究熱點。可提高蛋白質藥物 半衰期的技術包括化學修飾、蛋白質融合、微囊化、糖基化、抗蛋 白酶突變體等，許多長效蛋白質藥物已經研制成功并應用于臨床治 療。

融合蛋白是將兩個或多個基因的編碼區首尾連接，由同一調控 序列控制構成的基因表達產物。在分子水平，這個技術具有設計簡單 靈活的特性，因為構建突變體時不需要插入連接序列而直接在C端或 N端融合。因此，這種技術能廣泛地應用于構建生物活性分子，而且它 的應用性不會因為生物分子的大小或活性而受到限制。常選用半衰 期較長，分子量較大的分子作為載體構建融合蛋白，如人血清白蛋白 (HSA)或免疫球蛋白(IgG)的Fc片段應用最為廣泛。