[發(fā)明專利]高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌及其構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110321942.6
• 申請(qǐng)日: 2011-10-21
• 公開（公告）號(hào): CN102363763A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃鶴;段毅濤;吳偉;王喆;房振江;甘一如
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌為大腸桿菌 BL21(DE3)，其攜帶的質(zhì)粒中含有n個(gè)表達(dá)人PF4的基因，n＝1，2，3，4，5或6；質(zhì)粒的啟動(dòng)子為 IPTG誘導(dǎo)的T7Lac啟動(dòng)子，所述人血小板因子4為人PF4。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌，其特征在于所述n優(yōu) 選4，5或6。

3.權(quán)利要求1的高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步 驟：

(1)人PF4基因的擴(kuò)增：

將人PF4基因根據(jù)大腸桿菌基因翻譯的偏愛密碼子進(jìn)行改造，以SEQ?ID?No.1、SEQ?ID No.2分別為上、下游引物，兩者互為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ?ID?No.12序列；再以 SEQ?ID?No.12為模板，以SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.4分別為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到SEQ?ID?No.13序列；再以SEQ?ID?No.13為模板，以SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.6分別為 上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得SEQ?ID?No.16所示的人PF4的基因，將該基因克隆至 pEASY-T3載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到pEASY-T3-PF4/DH5α；

(2)PF4串聯(lián)單位及第一串聯(lián)單位的擴(kuò)增：

以質(zhì)粒pEASY-T3-PF4為模板，以SEQ?ID?No.7、SEQ?ID?No.8分別為上、下游引物，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，得到SEQ?ID?No.14序列；以SEQ?ID?No.9、SEQ?ID?No.10分別為上、下游引 物，兩者互為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ?ID?No.15序列；以SEQ?ID?No.14、SEQ?ID?No.15 分別為上、下游引物，兩者互為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PF4串聯(lián)單位序列，將所述串聯(lián) 單位克隆至pEASY-T1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到pEASY-T1-PF4/DH5α；

以質(zhì)粒pEASY-T1-PF4為模板，以SEQ?ID?No.11、SEQ?ID?No.8分別為上、下游引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得第一串聯(lián)單位序列，將所述第一串聯(lián)單位克隆至pEASY-T1載體中，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5α，得到pEASY-T1-fPF4/DH5α；

所述串聯(lián)單位為：EcoR?I酶切位點(diǎn)-Xho?I酶切位點(diǎn)-SD序列-ATG起始密碼子-His 標(biāo)簽-EK酶切位點(diǎn)-人PF4基因-TAATAA終止密碼子-Sal?I酶切位點(diǎn)；所述串聯(lián)單位用 序列表中SEQ?ID?No.17表示；

所述第一串聯(lián)單位為：EcoR?I酶切位點(diǎn)-ATG起始密碼子-His標(biāo)簽-EK酶切位點(diǎn)-人 PF4基因-TAATAA終止密碼子-Sal?I酶切位點(diǎn)；所述第一串聯(lián)單位用序列表中SEQ?ID No.18表示。

(3)PF4多拷貝載體的構(gòu)建：

對(duì)質(zhì)粒pEASY-T1-PF4進(jìn)行EcoR?I和Xho?I雙酶切，回收大片段；對(duì)質(zhì)粒pEASY-T1-f?PF4 進(jìn)行EcoR?I和Sal?I雙酶切，回收小片段；連接大、小片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，即可獲 得pEASY-T?1-2f?PF4/DH5α；

對(duì)質(zhì)粒pEASY-T1-PF4進(jìn)行EcoR?I和Xho?I雙酶切，回收大片段；對(duì)質(zhì)粒pEASY-T1-2f PF4進(jìn)行EcoR?I和Sal?I雙酶切，回收小片段；連接大、小片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，即可 獲得pEASY-T1-3fPF4/DH5α；如此反復(fù)進(jìn)行，可獲得pEASY-T1-nfPF4/DH5α，所述n＝1，2，3，4，5 或6；

(4)構(gòu)建多拷貝人PF4的基因工程菌：

對(duì)質(zhì)粒pET28a(+)和pEASY-T1-nf?PF4進(jìn)行EcoR?I和Sal?I雙酶切，分別回收大、小片段， 連接大、小片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，最終獲得工程菌pET28a(+)-nfPF4/BL21(DE3)， 所述n＝1，2，3，4，5或6。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所 述n優(yōu)選4，5或6。