[發明專利]一種mbr-FPGS高效表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201110321613.1
• 申請日: 2011-10-21
• 公開（公告）號: CN102337297A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 孫玉潔;胡文佳;韓曉
• 申請（專利權）人: 南京醫科大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00;A61P35/02;A61K31/519
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

1.一種mbr-FPGS高效表達載體，其特征在于：質粒載體為pEGFP-C1，在pEGFP-C1的CMV啟動子上游含有279bp長的mbr序列，在pEGFP-C1的HindⅢ和EcoRⅠ兩個酶切位點之間含有FPGS的蛋白質編碼區；其中，FPGS序列為說明書核苷酸和氨基酸序列表的序列1，mbr序列為說明書核苷酸和氨基酸序列表的序列2。

2.一種構建權利要求1所述的mbr-FPGS高效表達載體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）用Trizol法從Jurkat細胞中提取總RNA，經特異性逆轉錄引物將RNA逆轉錄成特異性cDNA，再經PCR擴增得到目的片段FPGS；特異性逆轉錄引物FPGS-reverse序列為5’-GGCCAGGCAGCGCACACAAT-3’；PCR引物為FPGS-F?：5’-CCCAAGCTTCTATGTCGCGGGCGCGGAGC-3’，FPGS-R?：5’-CCGGAATTCCTACTGGGACAGTGCGGGCT-3’；

（2）用HindⅢ和EcoRⅠ兩個酶分別切取質粒pEGFP-C1和片段FPGS，在T4連接酶的作用下，將酶切后的片段FPGS克隆至pEGFP-C1，制得FPGS-EGFP-C1質粒；采用酶切結合測序的方法鑒定FPGS-EGFP-C1質粒質量；

（3）以Jurkat細胞基因組DNA為模板，用PCR擴增Bcl2基因mbr序列，用AseⅠ酶分別切取純化后的mbr序列和FPGS-EGFP-C1質粒，在T4連接酶的作用下，連接切取后的兩個片段，構建出含有mbr序列的mbr-FPGS高效表達載體，采用菌落PCR結合測序的方法鑒定mbr-FPGS高效表達質粒質量；其中，PCR擴增Bcl2基因mbr序列的引物為：AseⅠ-mbrF:5’-AGTTATATTAATCTTTAGAGTTGCTTTACGTGGC-3’，AseⅠ-mbrR:5’-AGTTATATTAATAGGATAGCAGCACAGGATTG-3’。

3.權利要求1所述的mbr-FPGS高效表達載體在高效表達FPGS蛋白中的應用。

4.權利要求1所述的mbr-FPGS高效表達載體在制備用于增強腫瘤細胞對化療藥物MTX敏感性的藥物中的應用。

5.權利要求1所述的mbr-FPGS高效表達載體在制備用于治療人類白血病細胞對于化療藥物不敏感的藥物中的應用。