[發明專利]MALDI-TOF質譜雙內標及其定量檢測方法

有效

• 申請號: 201110321059.7
• 申請日: 2011-10-21
• 公開（公告）號: CN102337341A
• 公開（公告）日: 2012-02-01
• 發明（設計）人: 馬慶偉;張海燕;邢雙艷
• 申請（專利權）人: 馬慶偉
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N27/62
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及核酸，蛋白，小分子多肽，及其它小分子樣品的定量檢測，是一種利用MALDI-TOF-MS對小片段物質進行檢測時，引入已知濃度和比例的寡聚核苷酸作為標準樣品，建立標樣擬合曲線，用于校正實驗誤差的方法。

背景技術

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(Matrix-assisted?laser?desorption?lionization?time?of?flight?mass?spectrometry,?MALDI-TOF-MS)技術，是近年來飛速發展的蛋白質組學、基因組學技術之一，具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等特點，為生命科學研究與臨床重大疾病預警和輔助診斷等提供快速、高通量的分析測試手段，同時也是一種很好的篩選疾病的分子標記方法。

MALDI-TOF-MS的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比?（M/Z）與離子的飛行時間成正比，檢測離子。盡管MALDI-TOF-MS的準確度高達0.1%~0.01%，遠遠高于目前常規應用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術。但由于系統誤差等因素影響實驗結果的精確定量，因此在質譜檢測樣品時，引入已知濃度和比例的內標，建立標樣擬合曲線，可有效的校正質譜系統誤差和分子量偏移。

目前曲線擬合的方法在國內外均有較為普遍的應用，Jiangyue?Wu?等(?Anal.?Chem.?1997,?69,?3767-3771)利用MALDI-TOF-MS的擬合曲線法對環孢菌素進行了定量測試；Mazarin等(Anal.?Chem.?2006,?78,?2758-2764)結合脈沖梯度旋轉核磁共振和MALDI-TOF-MS定量測定多聚物時，同樣采用了擬合曲線進行數據校正；2009年，呂爽等人利用擬合曲線，成功開發了一種磷酸化肽的MALDI-TOF-MS定量方法。

發明內容

本發明原理是為了在使用MALDI-TOF-MS檢測生物分子（如核酸、蛋白、多肽、有機小分子物質等）時，有效克服系統誤差，而引入兩種已知濃度的寡聚核苷酸作為實驗雙內標的定量檢測方法。基于該原理，本發明還發明了用于該方法的三組寡核苷酸對。

????本發明的第一個目的是提供用作質譜檢測的雙內標志物（簡稱雙內標）的寡聚核苷酸對，其選自LbC/LbT、MbC/MbT或HbA/HbG。

在一個實施方案中，上述寡核苷酸對分別選自：

檢測低分子量待檢物的LbC(CTCATCATGCTGCCCC)和LbT(CTCATCATGCTGCCCT)；或

檢測中分子量待檢物的MbC(CCCCATCTAAGCGCATCAAAC)和MbT(CCCCATCTAAGCGCATCAAAT)；或

檢測高分子量待檢物的HbA(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAA)和HbG(GTTCTCACTCAATTGTAAATGCACAG)。

在一個具體實施方案中，上述LbC/LbT的分子量分別為4753.04、4768.05道爾頓，上述MbC/MbT的分子量分別為6304.08、6319.09道爾頓，上述HbA/HbG的分子量分別為7913.12、7929.12道爾頓。?

????本發明的第二個目的是提供一種使用上述寡核苷酸對以用于建立質譜檢測的內標標準擬合曲線的方法。

????在一個實施方案中，所述的方法包括：

1)??????合成上述寡聚核苷酸對作為雙內標標準品，備用；

2)??????對寡聚核苷酸進行稀釋；

3)??????將寡聚核苷酸稀釋到不同濃度范圍，通過質譜檢測得到合適的起始濃度；

4)??????按不同比例將寡聚核苷酸配成混液，質譜檢測，對所得到的數據進行分析，建立內標擬合曲線。

在一個實施方案中，步驟2的寡聚核苷酸稀釋方法既可用常規方法進行稀釋，也可使用本發明摸索確定的方法。其中，優選是選取相當于1OD₂₆₀的寡核苷酸干粉加500μl水進行稀釋，充分振蕩溶解，其中所選取寡核苷酸干粉的量的計算方法為：

寡核苷酸干粉量的摩爾數=1單位寡核苷酸質量/MW；

MW=(A堿基數x312)+?(C堿基數x288)+?(G堿基數x328)+?(T堿基數x303)-61；且