[發明專利]菲律賓蛤仔防御素Defensin A基因及其重組蛋白和應用

無效

• 申請號: 201110321024.3
• 申請日: 2011-10-14
• 公開（公告）號: CN102363783A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 吳惠豐;張林寶;趙建民;王清
• 申請（專利權）人: 中國科學院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;A61K38/17;A61P31/04;A61P37/04;A23K1/17;A23L3/3535
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明涉及抗菌肽，具體涉及一種菲律賓蛤仔防御素Defensin?A基因及其重組蛋白、以及構建方法和應用。?

背景技術

抗菌肽是生物體產生的一類由20-60個氨基酸組成的多肽，對真菌、細菌等病原微生物具有抑制或殺滅作用，通常被稱為“第二防御體系”。根據抗菌肽結構和三維構象的差異，可將抗菌肽分為以下四類：(1)具有α螺旋結構的線性肽，如蜂毒肽、蛙皮肽、天蠶抗菌肽等；(2)含有二硫鍵的β折疊結構，如防御素、昆蟲防御肽等；(3)由一種或多種氨基酸為主構成的多肽，如富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)前體蛋白剪切而來的多肽，如淡水螯蝦(Pacifastacus?leniusculus)的血藍蛋白C-端酶解后可產生具有抗菌活性的多肽。這類分子具有一些共同的特點：在生物體內合成迅速；具有廣譜抗菌活性，對細菌、真菌、原生動物等有作用，但對真核細胞無毒害；分子量一般在10kDa以下；多數是陽離子分子。抗菌肽的作用機理與傳統抗生素不同，它們的靶位點主要是病原體的細胞膜以增加膜的滲透性，因此不易產生抗性。抗菌肽不僅作用于革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌，還可以殺滅真菌、病毒、寄生蟲和腫瘤細胞，同時還能加速免疫和傷口愈合過程。由于病原菌對抗生素逐步產生抗藥性，抗菌肽為開發新的抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗腫瘤藥物開辟了廣闊的前景。在海洋貝類中，貽貝的抗菌肽研究較為透徹，根據其一級結構和二硫鍵形成的不同形式，貽貝抗菌肽又可分為四種類型：防御素(defensins)、貽貝素(mytilins)、貽貝肽(myticins)和貽貝霉素(mytimycins)。目前國內外關于菲律賓蛤仔抗菌肽及其抗菌活性的研究較少。趙建民等利用大腸桿菌原核表達系統，體外重組表達菲律賓蛤仔大防御素(VpBD)蛋白，具有廣譜的抗革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌。?

發明內容

本發明目的在于提供一種菲律賓蛤仔防御素Defensin?A基因及其重組蛋白、以及構建方法和應用。?

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：?

一種菲律賓蛤仔防御素Defensin?A基因：所述防御素Defensin?A基因為序列表SEQ?ID?NO.1中堿基序列所示。?

一種菲律賓蛤仔防御素Defensin?A基因重組蛋白：所述防御素Defensin?A基因重組蛋白為序列表SEQ?ID?NO.2中氨基酸序列所示。?

菲律賓蛤仔防御素Defensin?A基因重組蛋白的應用：所述防御素?Defensin?A基因重組表達產物可制備為抗菌藥物、免疫增強劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。所述防御素Defensin?A基因重組表達產物可作為制備革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌的抑菌藥物。革蘭氏陽性菌為巴氏葡萄球菌或金黃色葡萄球菌；革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、陰溝腸桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、產氣腸桿菌或副溶血弧菌。?

本發明所具有的優點：?

1.本發明從菲律賓蛤仔中克隆到防御素Defensin?A的全長cDNA序列，實現其重組表達并測定其抗菌譜和最小抑菌濃度，為菲律賓蛤仔的病害防治、基因輔助選育及進一步開發為醫藥產品和保鮮防腐劑奠定基礎。?

2.與現有技術相比，本發明的防御素Defensin?A為菲律賓蛤仔抗菌肽，對海洋來源的多種革蘭氏陽性和陰性病原微生物均具有很強的抑制活性，具有開發為廣譜抗菌類藥物、遺傳選育和飼料添加劑等方面的應用價值。?

具體實施方式

以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。?

本發明菲律賓蛤仔防御素Defensin?A的制備方法：?

1)總RNA提取：用Trizol試劑從感染鰻弧菌的菲律賓蛤仔的血淋巴中提取總RNA，存于-80℃備用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol試劑說明書進行；?

2)mRNA純化：用Oligotex?mRNA純化試劑盒將上述總RNA純化得到mRNA；純化方法依據QIAGENE公司的Oligotex?mRNA純化試劑盒說明書進行；?