[發(fā)明專利]一種用于檢測鋸緣青蟹呼腸孤病毒和雙順反子病毒的引物組、試劑盒及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110320470.2
• 申請日: 2011-10-20
• 公開（公告）號: CN102443655A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭志勛;馮娟;蘇友祿;張迪;吳開暢
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州知友專利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

1.一種用于檢測鋸緣青蟹呼腸孤病毒和雙順反子病毒的引物組，其特征是：包括鋸緣青蟹呼腸孤病毒引物組和鋸緣青蟹雙順反子病毒引物組，其中鋸緣青蟹呼腸孤病毒引物組包括呼腸孤病毒正向引物ReoF和反向引物ReoR，鋸緣青蟹雙順反子病毒引物組包括雙順反子病毒正向引物DicF和反向引物DicR，各引物具體如下：

ReoF：5-?ACTCATAGAGCAGTCATGGG-3

ReoR：5-?ATATCGTCAGAATGTCGTTC-3

DicF：5-?GGATACTATGGATGATGTTTC-3

DicR：5-?ACAAAATACCAGATAAAGCAA-3。

2.一種含有權(quán)利要求1所述引物組的鋸緣青蟹呼腸孤病毒和雙順反子病毒檢測試劑盒，其特征是含有以下部件：

(1)?A?液：用于RNA裂解，為Trizol液；

(2)?B液：用于RNA萃取，為氯仿；

(3)?C液：用于沉淀RNA，為異丙醇；

(4)?D液：用于洗滌RNA，為體積百分含量為70%的乙醇；

(5)?E液：用于溶解RNA，為內(nèi)裝DEPC水；

(6)?F液：RT反應(yīng)液；

(7)?G液：RT-PCR反應(yīng)液，含有權(quán)利要求1中所述的鋸緣青蟹呼腸孤病毒引物組呼腸孤病毒正向引物ReoF和反向引物ReoR以及鋸緣青蟹雙順反子病毒引物組雙順反子病毒正向引物DicF和反向引物DicR；

(8)?H液：陽性對照，內(nèi)裝鋸緣青蟹呼腸孤病毒和雙順反子病毒的陽性模板。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征是：所述的RT反應(yīng)液包括Buffer、dNTP、DEPC-H₂O、隨機(jī)引物、RNA酶抑制劑、二硫蘇糖醇DTT、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV?RT。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征是：所述的RT-PCR反應(yīng)液包括含mg²⁺的Buffer、dNTP、鋸緣青蟹呼腸孤病毒引物組呼腸孤病毒正向引物ReoF、反向引物ReoR、鋸緣青蟹雙順反子病毒引物組雙順反子病毒正向引物DicF、反向引物DicR和Taq酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征是：其中呼腸孤病毒引物組和雙順反子病毒引物組的摩爾比為1-5:1。

6.一種利用權(quán)利要求2-5任一項試劑盒檢測鋸緣青蟹呼腸孤病毒和雙順反子病毒的二重RT-PCR方法，其特征是含以下步驟：

(1)?取待檢樣品置于A液中，冰浴勻漿后室溫靜置，得勻漿液；

(2)?在上述勻漿液中加入B液，混勻后靜置；

(3)?離心，取上清液，加入等體積C液，靜置后離心；

(4)?棄上清液，用D液洗滌后，離心，得洗滌液；

(5)?將洗滌液吹干，加入E液溶解，得到鋸緣青蟹呼腸孤病毒和雙順反子病毒的RNA提取液；

(6)?將鋸緣青蟹呼腸孤病毒和雙順反子病毒的RNA提取液溫育后，冷卻；

(7)?取冷卻后RNA提取液，加入F液中，孵育并失活后，得到RT-PCR反應(yīng)模板；

(8)?取RT-PCR反應(yīng)模板和陽性對照H液加入到G液中，混勻后離心，置于PCR儀器中；

(9)?在PCR儀器中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；

(10)?反應(yīng)結(jié)束后加溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳20-30分鐘后于紫外儀上觀察，若在與陽性對照相同的位置同時出現(xiàn)兩條明亮的反應(yīng)條帶，則為兩種病毒陽性，說明待測樣品含兩種病毒，其中呼腸孤病毒和雙順反子病毒帶的位置分別為304?bp和404bp；若只在304?bp處出現(xiàn)一條帶，則為呼腸孤病毒陽性；若只在404bp處出現(xiàn)一條帶，則為雙順反子病毒陽性；否則為陰性。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是：步驟(1)中待檢樣品與A液的質(zhì)量體積比為0.05-0.1g：0.5-1mL；步驟(2)中勻漿液與B液的體積比為1-10：1；步驟(3)中上清液與C液的體積比為1：1?。