[發(fā)明專利]一種結核分枝桿菌特異性標志物及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110320129.7
• 申請日: 2011-10-20
• 公開（公告）號: CN103063843A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設計）人: 張舒林;趙俊偉;張苗苗;付少剛;郭曉奎;孫戰(zhàn)強
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫(yī)學院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽;施春花

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，更具體地講，涉及一種結核病診斷試劑及其制備方法和應用。

背景技術

快速、準確的診斷結核分枝桿菌(MTB)感染，對于結核病的控制具有重要意義。MTB感染的診斷方法有很多，目前臨床最為常用的方法仍然依靠傳統(tǒng)的痰涂片細菌學檢查，但檢出率低；MTB培養(yǎng)可做為結核病確診的“金標準”，但其培養(yǎng)時間太長，一般4-6周，難以滿足臨床需要；Bactec技術雖縮短了培養(yǎng)時間，但費用較高，短時間內難以推廣普及；X線和CT檢查僅提供影像學可能性診斷；聚合酶鏈反應（PCR）技術及其它基因診斷方法作為臨床診斷尚存在操作復雜的困難，對技術和人員專業(yè)素質要求較高，且仍不能用于菌陰結核病的快速診斷。而MTB感染的血清免疫學診斷以其固有的操作簡便、快速、可用肉眼判斷結果、穩(wěn)定性好、便于推廣、無需特殊精密儀器等優(yōu)勢，是新形勢下最可能滿足經濟不發(fā)達地區(qū)和結核病高發(fā)區(qū)所亟需的結核病診斷技術。

發(fā)明內容

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種結核分枝桿菌特異性標志物。?

本發(fā)明的第二個目的在于提供Rv3119重組蛋白在制備結核診斷試劑中的應用。

本發(fā)明的第三個目的在于提供Rv3119重組蛋白在制備結核診斷試劑盒中的應用。

本發(fā)明的第四個目的在于提供一種檢測結核病的試劑盒。

為實現以上目的，本發(fā)明公開以下技術方案：本發(fā)明的一個方面，提供了一種新的結核分枝桿菌特異性標志物Rv3119重組蛋白。

本發(fā)明提供了一種新的重組質粒，即將Rv3119基因序列插入商用表達質粒序列中。Rv3119基因NCBI登陸號為BX842582.1；基因名稱為moaE1；蛋白號為：CAE55554.1。

本發(fā)明的“Rv3119基因序列”也包括對BX842582.1中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與BX842582.1核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼相同的氨基酸序列。該術語還包括在中度嚴密條件下，更佳地在高度嚴密條件下與BX842582.1的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與BX842582.1的核苷酸序列同源性至少70%，更佳地至少90%的核苷酸序列。

本發(fā)明的重組質粒，通常將Rv3119基因插入表達質粒的多克隆位點處得到。

本發(fā)明的重組質粒在制備過程中，可選用本領域已知的各種載體，然后將編碼本發(fā)明的核苷酸序列可操作性地連接于表達調控序列，從而形成蛋白表達載體。

本發(fā)明中可采用的載體包括且不僅限pET28a、pET28b、pET30a和pET32a。本發(fā)明的一個實施例中，所用的質粒為pET28b。

本發(fā)明的另一方面，提供了一種結核分枝桿菌相關重組蛋白，該蛋白是將插入Rv3119基因的重組表達質粒轉入宿主細胞而得到的。

用作檢測試劑的Rv3119重組蛋白與NCBI上的CAE55554.1蛋白序列相比，加入了載體相關序列和純化標簽。例如，使用pET28b質粒時，蛋白序列后面加了pET28b上的相關序列和一段His?Tag純化標簽。

所用的宿主細胞應當與表達質粒相匹配?？墒褂迷思毎蛘哒婧思毎?，例如常用的大腸桿菌（E.?coli）。用于轉化的宿主細胞可以是BL21（DE3）或BL21?plysS（DE3）菌株等。本發(fā)明的一個實施例中所用的就是BL21?plysS（DE3）菌株。

本發(fā)明的另一方面，提供了上述Rv3119重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：

（1）結核分枝桿菌H₃₇Rv基因組DNA的制備；

?（2）Rv3119基因的PCR擴增；

?（3）Rv3119基因表達質粒構建和鑒定；

?（4）將步驟（3）構建的表達質粒轉化入宿主細胞；

?（5）誘導表達蛋白Rv3119；

（6）分離純化誘導表達產物，得到Rv3119重組蛋白。

上述制備方法中，各種實驗參數均按常規(guī)操作選擇，可視具體實驗條件而定。