[發明專利]一種檢測凝血酶的電化學發光傳感器的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201110317670.2
• 申請日: 2011-10-19
• 公開（公告）號: CN102507689A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 混旭;陳懷成;王衛
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

????本發明屬于分析化學與電化學發光傳感器領域，具體為一種檢測凝血酶的電化學發光傳感器的制備方法及應用。另外，本發明還涉及采用所述的電化學發光傳感器檢測凝血酶的方法。

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背景技術

????凝血酶（Thombin）作為一種重要的蛋白酶，在血液凝固、炎癥和創傷愈合等生理及病理過程中發揮著重要作用。由于惡性腫瘤患者常有不同程度的出血傾向，腫瘤組織對周圍組織侵襲、腫瘤細胞轉移以及腫瘤組織和腫瘤患者血液本身的變化，均可改變患者的凝血機制。衡量凝血機制的重要指標之一就是檢測凝血酶的濃度，這為揭示腫瘤的發生機制，以及作為臨床早期診斷、療效及預后判斷具有重大意義。

????目前測定凝血酶的傳統方法主要有熒光法和發色底物法，其靈敏度不高，不滿足實際檢測要求。適體是利用指數富集配基的系統進化（Systematic?Evolution?of?Ligands?by?Exponential?Enrichment,?SELEX）技術篩選出來的。能夠與目標蛋白等進行高親合性、高特異性的結合，其特異性可與抗原抗體相媲美。同時適體穩定、便宜、易合成、可再生，因而近年來成為蛋白分析的有力工具之一。目前利用適體的識別進行凝血酶檢測方法主要為二茂鐵淬滅釕聯吡啶電化學發光等方法[Yan?Li,?Honglan?Qi,?Yage?Peng,?Qiang?Gao,?Chengxiao?Zhang.?Electrochem.Commun.,?2008,?10,?1322-1325;?Hongying?Zhu,?Jonathan?D.?Suter,?Ian?M.?White,?Xudong?Fan.?Sensors?2006,?6(8),?785-795;?Anna?Pasternak,?Frank?J.?Hernandez,?Lars?M.?Rasmussen,?Birte?Vester,?Jesper?Wengel.?Nucl.?Acids?Res.?2011,?39(3),?1155-1164]。這些方法各有其優點，能不同程度的滿足對凝血酶的檢測要求，但方法的靈敏度不高。所以必須發展一種靈敏度高，簡單的新型檢測方法。

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發明內容

????鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種檢測凝血酶的電化學發光傳感器的制備方法及應用，以及提供一種采用所述的電化學發光傳感器檢測凝血酶的方法。

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本發明的目的是這樣實現的：??????????????????????????????????????????????

一種檢測凝血酶的電化學發光傳感器的制備方法，包括如下步驟：

（1）將金電極浸入0.5×10^-7～1.5×10^-7?M的DNA1中，37℃固定4?h后，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液沖洗，再用0.5×10^-3～1.5×10^-3?M?的巰基己醇封板，用PBS溶液沖洗金電極；

（2）取DNA雜交液于小樣品管中，37℃浸泡金電極進行雜交，之后用PBS沖洗金電極；

（3）取發光探針溶液于小樣品管中，將金電極插入其中在37℃浸泡進行再雜交，然后用PBS?緩沖液沖洗金電極，從而制得電化學發光生物傳感器；

其中：所述的DNA雜交液按如下方法制備而成：在小樣品管中加入DNA1，然后再加入DNA2，37℃下雜交后，向其中加入凝血酶，室溫下反應后再加入DNA3，37℃下反應后加入Tris-HCl緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶Phi?29，37℃反應；然后加入Tris-HCl緩沖液、DNA?剪切酶Nb.BbvCI，37℃條件下反應，即得；

所述的發光探針溶液按如下方法制備而成：在小樣品管中加入依次加入pH為8.2的Tris-HCl、TCEP、DNA4、巰基乙胺，室溫放置20-60min后加入金納米粒子，室溫下反應10-14?h后加入pH為9.0的硼酸緩沖液，取活化的聯吡啶釕，室溫下震蕩反應過夜，將溶液于4?℃，10000?r/min下離心，棄去上清液，加入Tris-HCl緩沖液洗滌后定容，即得；

所述的DNA1的部分序列為5`-CCAACCACACCAACCCAC-3`；

所述的DNA2的部分序列為3`-GGTTGGTGTGGTTGGGTGCTC-5`；

所述的DNA3的部分序列為：