[發明專利]一種抑制水牛膜分化抗原14 基因表達的小核糖核酸分子

無效

• 申請號: 201110317404.X
• 申請日: 2011-10-19
• 公開（公告）號: CN102533758A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 王鳳陽;杜麗;雷明;焦寒偉;成鷹;張冬琳;郝永昌
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12Q1/68
• 代理公司: 西安弘理專利事務所 61214
• 代理人: 羅笛

1.一種抑制水牛膜結合型白細胞分化抗原14基因表達的小核糖核酸分子，其特征在于，

所述的小核糖核酸分子基因序列信息是：

正義，CGAGGUAAAUGACC?UGACUTT(5’-3’)；

反義，AGUCAGGUCAUUUACCUCGTT(5’-3’))。

2.一種抑制水牛膜結合型白細胞分化抗原14基因表達的小核糖核酸分子的生物學用途，其特征在于，

所述的小核糖核酸分子基因序列信息是：

正義，CGAGGUAAAUGACC?UGACUTT(5’-3’)；

反義，AGUCAGGUCAUUUACCUCGTT(5’-3’))，

或者，所述的小核糖核酸分子計算機可讀版本是，

<110>王鳳陽

<120>抑制水牛膜結合型白細胞分化抗原14基因表達的小核糖核酸分子

<160>1

<210>1

<211>21

<212>RNA

<213>水牛

<400>1

cgagguaaau?gaccugacut?t??21

，

該小核糖核酸分子應用于核糖核酸干擾技術，能特異且高效抑制水牛膜結合型白細胞分化抗原14蛋白表達，增強水牛抵抗革蘭氏陰性菌感染的能力。

3.根據權利要求2所述的小核糖核酸分子的生物學用途，其特征在于：根據水牛膜結合型白細胞分化抗原14(mCD14)基因的序列，所述的小核糖核酸分子，按照以下基本原則合成：

1)GC含量30％-52％；

2)sense鏈的15-19堿基中至少含有3個A/U；

3)不含有反向重復序列；

4)sense鏈的第19堿基為A；

5)sense鏈的第3堿基為A；

6)sense鏈的第10堿基為U；

7)sense鏈的第19堿基不是G/C；

8)sense鏈的第13堿基不是G。

4.一種抑制水牛膜結合型白細胞分化抗原14基因表達的小核糖核酸分子的生物學篩選方法，其特征在于，該方法按照以下步驟實施：

步驟1、重組表達質粒pEGFP-mCD14的構建，具體步驟如下：

將pEGFP-C1表達載體轉化DH5a感受態細胞，取50微升菌液涂布于Luria-Bertani固體培養基上，含卡那霉素，37℃倒置培養24小時，挑取單菌落接種于3毫升Luria-Bertani培養液中，含卡那霉素，37℃振蕩24小時，12000轉數/分鐘離心2分鐘，收集菌體，小量質粒提取試劑盒提取pEGFP-C1質粒；用EcoRI和Kpn1雙酶切回收純化的聚合酶鏈式反應產物和pEGFP-C1表達載體，在T4DNA連接酶的作用下，將酶切后的目的片段與真核表達載體pEGFP-C1進行連接，最終獲得重組表達質粒pEGFP-mCD14；

步驟2、穩定表達增強型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結合型白細胞分化抗原14融合蛋白的人胚腎293細胞系的構建，具體步驟如下：

人胚腎293細胞在含10％體積分數胎牛血清的杜比克改良伊格氏完全培養基中，于37℃、5％體積分數二氧化碳的飽和濕度下培養；按照轉染試劑操作說明書將重組質粒pEGFP-mCD14的轉染入人胚腎293細胞內，簡述如下：

(1)在轉染的前一天，計數人胚腎293細胞并鋪于6孔板中，使轉染時細胞密度達到60-80％；

(2)在轉染當天，用250微升無血清的優化改良伊格氏完全培養基I分別稀釋2微克EGFP-mCD14質粒和6微升轉染試劑，輕輕混勻；

(3)孵育5分鐘后，將稀釋的質粒和轉染試劑混合，輕微混勻后于室溫孵育20分鐘以利于形成脫氧核糖核酸DNA-轉染試劑復合物；

(4)將脫氧核糖核酸DNA-轉染試劑復合物直接加入含細胞和無雙抗培養基的6孔板中，十字形輕搖以混勻；

轉染24小時后，換完全培養基培養24小時，用0.25％胰蛋白酶消化細胞，按1∶10-20的比例稀釋傳代，待細胞貼壁后，在含有氨基糖苷類抗生素500微克/毫升的選擇性培養基中加壓篩選，獲得具有抗生素抗性的陽性細胞克隆；采用極限稀釋法將克隆稀釋至96孔板進行單克隆篩選，再將篩選出的單克隆擴增培養從而獲得穩定表達增強型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結合型白細胞分化抗原14融合蛋白的人胚腎293細胞，對穩定細胞系進行熒光顯微鏡檢測和Western?Blot鑒定，

通過比較，穩定表達增強型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結合型白細胞分化抗原14融合蛋白的人胚腎293細胞正確表達增強型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結合型白細胞分化抗原14融合蛋白；

步驟3、有效抑制水牛膜結合型白細胞分化抗原14基因表達的小核糖核酸分子siRNAs的合成與合成，

根據水牛膜結合型白細胞分化抗原14基因的序列，按照小核糖核酸分子siRNAs合成的基本原則，合成四對不同的針對膜結合型白細胞分化抗原14的小核糖核酸分子siRNAs；

步驟4、按照高效轉染試劑操作說明書的方法將四對小核糖核酸分子siRNAs轉染人胚腎293細胞穩定細胞系，具體步驟如下：

(1)用900微升完全培養基將5×105個細胞鋪于12孔板內；

(2)分別用100微升無血清的Opti-MEM?I培養基稀釋9微升濃度為20微摩爾濃度的小核糖核酸分子siRNAs和9微升高效轉染試劑轉染試劑，將兩者混合，充分混勻，室溫放置5-10分鐘；

(3)將形成的轉染復合物滴入細胞培養孔內，與人胚腎293細胞穩定細胞系混合，十字形輕搖以混勻，放入二氧化碳培養箱培養；

(4)37℃培養24小時后，更換新鮮的含10％胎牛血清的700微升杜比克改良伊格氏完全培養基；

步驟5、分別檢測各項指標

5.1)轉染48小時后，用倒置熒光顯微鏡觀察增強型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結合型白細胞分化抗原14融合蛋白表達的熒光強度，倒置熒光顯微鏡，檢測增強型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結合型白細胞分化抗原14融合蛋白的蛋白表達情況，

通過比較，其中的siRNA4小核糖核酸分子能夠明顯抑制增強型綠色熒光蛋白EGFP-水牛膜結合型白細胞分化抗原14融合蛋白的表達；

5.2)轉染48小時后，流式細胞術檢測增強型綠色熒光蛋白GFP-水牛膜結合型白細胞分化抗原14融合蛋白的蛋白表達水平，流式細胞儀采用激發波長408nm，發射波長507nm，檢測表達EGFP的細胞數量和平均熒光強度，

通過比較，其中的siRNA4小核糖核酸分子siRNAs能夠明顯抑制水牛膜結合型白細胞分化抗原14的表達；

5.3)轉染48小時后，吸出培養液，磷酸鹽緩沖液洗滌細胞層1-2次，0.125％的胰酶常規消化，收集細胞。根據細胞沉淀的情況，加入細胞裂解液50毫摩爾濃度三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH為8.0，150納摩爾濃度氯化鈉，1％毫摩爾濃度的聚乙二醇辛基苯基醚，0.2％毫摩爾濃度疊氮鈉，0.5％毫摩爾濃度脫氧膽酸鈉，10微克/毫升抑肽酶aprotinin，1微克/毫升苯甲基磺酰氟；利用二喹林甲酸蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度，將總蛋白等量上樣，在12％的分離膠的濃度下進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，

電泳完畢后進行蛋白質印跡，通過比較，其中的siRNA4小核糖核酸分子siRNAs能夠明顯抑制水牛膜結合型白細胞分化抗原14的表達，

綜上所述，找出其中顯著表現出能特異且高效抑制水牛膜結合型白細胞分化抗原14蛋白表達的一個小核糖核酸分子siRNA。