[發(fā)明專利]一種檢測甘蔗宿根矮化病菌的實時熒光定量PCR方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110316557.2
• 申請日: 2011-10-18
• 公開（公告）號: CN102312016A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設計）人: 王恒波;郭晉隆;許莉萍;高三基;陳如凱;陳平華
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種利用實時熒光定量PCR方法檢測甘蔗宿根矮化病菌的引物及探針，其特征在于：所述的引物為以下序列的引物對：正向引物序列5’-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3’，反向引物序列5’-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3’，探針序列是FAM-5-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3-TAMRA。

2.一種根據(jù)權利要求1所述的引物及探針檢測甘蔗宿根矮化病病菌的實時熒光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）宿根矮化病病菌的Pat1基因片段的克隆及標準曲線繪制：以宿根矮化病致病菌DNA為模板，采用所述引物對進行PCR擴增，切膠純化，連接到PMD18-T載體上，選擇陽性克隆，提取質粒DNA，得到宿根矮化病菌的Pat1基因，測定質粒DNA的吸光值，并將吸光值轉化成質粒DNA的濃度，再將質粒DNA的濃度轉化成為拷貝數(shù)，進行梯度稀釋，并以稀釋后的質粒DNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增，繪制標準曲線，構建標準曲線方程；

（2）以待測樣品蔗汁DNA為模板，用所述引物與探針進行實時熒光定量PCR擴增，通過將產生的的Ct值代入標準曲線方程轉化成起始反應的DNA分子拷貝數(shù)，即一個分子拷貝數(shù)代表一個白條病菌，從而定量檢測甘蔗樣品中感染宿根矮化病菌的數(shù)量。

3.根據(jù)權利要求2所述檢測甘蔗宿根矮化病病菌的實時熒光定量PCR方法，其特征在于：所述實時熒光定量PCR擴增的反應體系為25μL：2×TaqMan?Universal?Master?Mix?12.5μL；10μmol/L正向引物與反向引物各0.75μL；10μmol/L探針0.4μL；DNA模板1.0μL；補水至25μL。

4.根據(jù)權利要求2所述檢測甘蔗宿根矮化病病菌的實時熒光定量PCR方法，其特征在于：所述實時熒光定量PCR擴增的反應條件為：50?℃，2?min，預變性95?℃，10?min；95?℃，15?s；60?℃，退火延伸，1?min，40個循環(huán)，在60℃進行單點熒光檢測。